高密度脂蛋白亚组分促胆固醇逆转运及抗氧化功能研究*

谭迎，田迪，刘挺榕，赖文岩，郭志刚

高密度脂蛋白(HDL)是一个复杂的多功能蛋白复合体，可通过其促进胆固醇逆转运、抗炎、抗氧化及抗血栓形成等多种功能发挥抗动脉粥样硬化作用，其中，促胆固醇逆转运功能最为关键。然而，最近的研究发现，在急性期反应、慢性炎症以及一些代谢性疾病中，HDL的抗动脉粥样硬化减弱，甚至出现致动脉粥样硬化作用［1-3］。Shao 等［4］研究证实，氧化损伤可损害HDL主要组成蛋白载脂蛋白A-I(apoA-I)促胆固醇逆转运功能，其机制可能与HDL发生氧化修饰有关。Heinecke等［5］发现从冠心病患者血浆分离出的HDL中髓过氧化物酶的两种产物(氯酪氨酸和硝基酪氨酸)均明显升高，推测冠心病患者HDL抗氧化功能可能受到了损害。急性冠状动脉(冠脉)综合征(ACS)发生时，机体处于一种特殊的炎症及氧化应激状态，因此我们推测ACS的发生可能损害HDL胆固醇逆转运及抗氧化功能，从而使HDL抗动脉粥样硬化作用减弱甚至出现致动脉粥样硬化作用。HDL亚组分主要由HDL2和HDL3组成，目前国内外关于HDL2和HDL3抗动脉粥样硬化作用的强弱仍存在许多争议。为此，本研究通过检测健康人群及ACS患者HDL亚组分介导的胆固醇转出率及脂氢过氧化物(LOOH)水平，以明确ACS患者HDL亚组分促胆固醇逆转运及抗氧化功能是否受到了损害，同时探讨HDL2和HDL3抗AS作用的强弱。

1 对象和方法

研究对象:2011-01至2012-01选取我院心内科住院的ACS患者(ACS组)40例，男27例，女13例，平均年龄(51.5±6.2)岁。入选标准:经确诊的ACS患者应符合不稳定性心绞痛临床表现、冠状动脉(冠脉)造影示至少有一支血管狭窄＞50%、心肌酶谱及肌钙蛋白升高和/或心电图有动态改变。排除标准:高血压未控制平稳、糖尿病、肝肾功能异常、甲状腺功能异常、肿瘤、自身免疫性疾病、任何急性或慢性炎症性疾病、甘油三酯≥5mmol/L及体重指数(BMI)≥30 kg/m2者、近6周内服用调脂药物者。我院同期健康体检者(对照组)40例，男27例，女13例，平均年龄(49.2±5.0)岁，无冠心病及高脂血症病史，除外高血压、糖尿病、肝肾功能异常、甲状腺功能异常、肿瘤、自身免疫性疾病、任何急性或慢性炎症性疾病及血脂代谢异常相关疾病者。本研究已通过伦理委员会批准，所有入选者均为自愿参加本研究并签署知情同意书。

血脂及高敏C-反应蛋白(hs-CRP)检测:抽取两组人群清晨空腹静脉血5ml，静置30 min后离心取血清，置于－80℃冰箱保存备用。采用酶学终点比色法在全自动生化分析仪上检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度;采用透射比浊法检测血清高敏C-反应蛋白浓度。

高密度脂蛋白亚组分(HDL2和HDL3)分离提取:采用Karlsson等［6］两步非连续性超高速密度梯度离心方法分离提取HDL亚组分。乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血20ml，离心后收集血浆并加入乙二胺四乙酸(1mg/ml)和蔗糖(终浓度0.5%)以防HDL氧化和凝集。用固体溴化钾(0.3816 g/ml)调整血浆(取4ml)密度至1.24 g/ml，置于规格为8.9ml离心管底部，上缓慢加入溴化钾/磷酸盐缓冲液(0.0834 g/ml，密度1.063 g/ml)，用考马斯亮蓝着色蛋白(此试管作为分离收集HDL的参考)。配平后置于超高速离心机(Beckman L-80 XP，Ti90转子，固定转角，购自美国基因仪器公司)中以290000 g于15℃离心4 h，离心后离心管上层为及低密度脂蛋白和低密度脂蛋白，中层为HDL2和HDL3。用注射器穿刺离心管分别抽取HDL2和HDL3，置两离心管中，再于其上分别缓慢加入溴化钾/PBS溶液(0.3816 g/ml，密度至 1.24 g/ml)，290000 g于15℃离心2 h后，HDL2和HDL3均漂浮于离心管上层，分别收集上层液体。将两种液体分别在含200 μmol/L乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液中透析48 h，超滤除菌，4℃保存。

高密度脂蛋白亚组分介导的巨噬细胞氚三胆固醇转出率检测［7］:将J774巨噬细胞(美国，American Type Culture Collection公司)接种在24孔培养板上(细胞浓度2×105/ml)，以 DMEM 培养液(含 0.2%BSA)于37℃、5%CO2培养箱中静置培养，同时在培养液中加入氚三胆固醇(终浓度1μCi/mL;美国PerkinElmer公司)及促进细胞吸收胆固醇的氧化低密度脂蛋白(终浓度30 μg/ml)，培养24 h后弃去培养基，以无血清DMEM培养液洗涤2次后，再次加入DMEM全培养液(含0.2%BSA)及8-溴-磷酸腺苷(8-Br-cAMP终浓度0.3mmol/L)培养12 h后去培养液。以无血清DMEM培养液洗涤1次，再次加入DMEM全培养液(含0.2%BSA)，同时加入待测的 HDL2或 HDL3(50 μg/ml)，4 h后收集培养液并用0.45 μm玻璃纤维过滤器过滤后移出细胞碎片，细胞用磷酸盐平衡盐溶液洗涤并用1ml氢氧化钠(0.1 mol/L)完全溶解。最后利用液闪计数仪检测细胞溶解物及细胞介质的氚三放射量。氚三胆固醇转出率用细胞介质中氚三胆固醇放射量占总放射量(细胞内+细胞介质)的百分比表示。

高密度脂蛋白亚组分(HDL2和HDL3)脂氢过氧化物(LOOH)含量检测［8］:采用二甲苯酚橙显色实验法检测。取 HDL2或 HDL3溶液 90 μl，加 10 μl硫胺素焦磷酸(10mmol/L)或甲醇混匀，37℃反应30 min;加入 FOX 反应液(250 μmol/L 硫酸亚铁、100 μmol/L二甲酚橙、25mmol/L H2SO4、4mmol/L 2，6-二叔丁基对甲酚，溶于90%甲醇中)900 μl，混匀，室温反应30 min;室温下12000 g离心5 min。取上清液测D560 nm值，以加与不加硫胺素焦磷酸两管的D 560 nm值之差计算LOOH含量。

统计学分析:采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示。检验各组变量正态分布情况，非正态分布的变量经对数转换后使之正态化后再分析;采用F检验进行方差齐性检验，两样本均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组基本临床资料比较:与对照组比较，ACS组血清LDL-C水平及高敏C-反应蛋白浓度均明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.001);两组年龄、总胆固醇、甘油三酯及HDL-C水平比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。表1

表1 两组基本临床资料比较()

表1 两组基本临床资料比较()

注:与对照组比较*P=0.004 ＊＊P＜0.001

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两组HDL亚组分(HDL2和HDL3)介导的巨噬细胞氚三胆固醇转出率比较:ACS组HDL2、HDL3介导的氚三胆固醇转出率均低于对照组，差异具有统计学意义(P均＜0.001)。表2

表2 两组HDL亚组分HDL2和HDL3促胆固醇逆转运及抗氧化功能比较()

表2 两组HDL亚组分HDL2和HDL3促胆固醇逆转运及抗氧化功能比较()

注:与对照组比较*P＜0.001;与同组内 HDL2比较△P＜0.05△△P＜0.001 ACS:急性冠脉综合征;LOOH:脂氢过氧化物;HDL:高密度脂蛋白

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两组HDL亚组分(HDL2和HDL3)LOOH水平比较:与对照组相比，ACS组HDL亚组分的HDL2-LOOH及HDL3-LOOH水平均升高，差异均具有统计学意义(P均＜0.001)。表2

两组同组内HDL亚组分HDL2和HDL3功能比较:对照组及ACS组的HDL3介导的巨噬细胞氚三胆固醇转出率均较HDL2明显下降，差异均有统计学意义(P＜0.05);对照组及ACS组的HDL亚组分HDL3-LOOH水平则均较HDL2-LOOH明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05～0.001)。表2

3 讨论

近年来，大量研究证实HDL功能较高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平更能预测动脉粥样硬化及冠心病发生风险，其中HDL介导的逆胆固醇转运功能尤为重要。2011年Khera等［9］在新英格兰杂志上发表的文章显示:HDL-C与颈动脉内膜中层厚度(IMT)之间无明显相关关系，而HDL介导的巨噬细胞胆固醇转出率与颈动脉内膜中层厚度(IMT)和冠心病发生风险呈高度负相关，此相关关系独立于 HDL-C水平，表明HDL介导的促胆固醇逆转运功能可独立于HDL-C水平更好地预测AS及冠心病发生风险。本研究两组人群HDL-C水平无统计学差异，但ACS组患者促胆固醇逆转运功能较正常对照组明显下降(P＜0.001)，直接表明了HDL-C水平并不能完全代表HDL功能，进一步确证了HDL促胆固醇逆转运功能可独立于HDLC水平更好地预测AS发生风险。结构决定功能，对HDL亚组分结构及改善HDL功能药物的研究有望为AS及冠心病的防治提供新的干预手段。

炎症反应在ACS的发生发展中起重要作用，本研究ACS组患者较对照组高敏C-反应蛋白明显升高，亦可说明［10］。严晓伟等［11］报道显示，炎症性疾病中，HDL中磷脂含量降低、载脂蛋白A-I的氧化及糖基化修饰等均可以导致HDL与巨噬细胞的结合减少，从而使HDL介导的细胞内胆固醇的外流受抑制。与其报道相一致，我们的研究发现ACS的发生可使HDL亚组分介导的细胞内胆固醇的外流受抑制，其机制可能与炎症条件下HDL亚组分结构重塑及组成蛋白的改变有关。

脂氢过氧化物(LOOH)是评估HDL抗氧化功能的一个重要指标。它可通过与HDL结合氧化HDL，导致HDL抑制氧化型低密度脂蛋白产生的能力减弱，甚至使HDL出现促氧化作用。研究发现，在全身炎症的条件下，HDL的结构会被修饰，从而降低了其抗炎抗氧化功能，甚至促进氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的形成加重斑块内的炎症反应［12］。本研究显示，与对照组比较，ACS患者HDL亚组分LOOH水平明显升高(P＜0.001)，证实ACS的发生可损害HDL亚组分的抗氧化功能，甚至可能使HDL亚组分转变为具有促氧化作用的失功能颗粒加剧ACS的发展。Alwail等［10］等通过蛋白组学方法发现，与正常对照组相比，急性冠脉综合征组患者其HDL组成发生改变，蛋白载脂蛋白A-IV水平较对照组显著减少，而血清淀粉样蛋白A(SAA)及补体3(C3)等炎症蛋白则较对照组明显增加，表明ACS患者HDL中炎性蛋白的增加可能是HDL发生失功能改变的重要机制。

血浆中HDL亚组分主要以HDL2和HDL3为主，HDL3为小的、密度较大、未成熟的颗粒，HDL2为大的、密度较小、成熟的颗粒［13］。研究发现，HDL2较HDL3包含有更多的载脂蛋白A-I(apoA-I)，而HDL3包含有更多的载脂蛋白A-Ⅱ(apoA-Ⅱ)，且其与载脂蛋白L-I、载脂蛋白F、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白M、载脂蛋白J、载脂蛋白D、屛氧酶1、屛氧酶3和血清淀粉样蛋白 A(SAA)等蛋白更为相关［14，15］。大量研究证实HDL2较HDL3具有更好地心血管保护作用，但亦有一些专家认为，二者具有同等程度的心血管保护作用［16，17］。本研究证实，HDL2较 HDL3有更强的促胆固醇逆转运及抗氧化功能，提示HDL2可能较HDL3具有更好的心血管保护作用。有报道显示，血清淀粉样蛋白A可选择性损害HDL3促胆固醇逆转运功能［14］，因而推测血清淀粉样蛋白A可能是HDL亚组分功能差异的重要因素。

总之，本研究证实，ACS的发生可损害HDL亚组分的促胆固醇逆转运及抗氧化功能，这也直接表明HDL-C水平并不能完全代表HDL功能，HDL亚组分介导的促胆固醇逆转运功能可独立于HDL-C水平更好地预测动脉粥样硬化和冠心病发生风险。同时还发现HDL2较HDL3具有更强的促胆固醇逆转运及抗氧化功能，其具体机制尚未明确。可见，对异常HDL功能的评估及HDL亚组分的深入研究是十分必要的，有望为动脉粥样硬化及冠心病的防治提供新的思路。此外，由于时间的限制，本研究仍存在不足之处，即缺少稳定性心绞痛组与ACS组进行对照，无法明确HDL亚组分功能在稳定性心绞痛患者和ACS患者是否亦存在差异，更进一步的深入研究有待进行。

［1］Ansell BJ，Watson KE，Fogelman AM，et al.High-density lipoprotein function recent advances.J Am CoU Cardiol，2005，46:1792-1798.

［2］deGoma EM，deGoma RL，Rader DJ.Beyond high-density lipoprotein cholesterol levels evaluating high-density lipoprotein function as influenced by novel therapeutic approaches.J Am Coll Cardiol，2008，51:2199-2211.

［3］Sviridov D，Mukhamedova N，Remaley AT，et al.Antiatherogenic functionality of high density lipoprotein:how much versus how good.J Atheroscler Thromb，2008，15:52-62.

［4］Shao B，Oda MN，Oram JF，et al.Myeloperoxidase:an inflammatory enzyme for generating dysfunctionalhigh density lipoprotein.Curr.Opin.Cardiol，2006，21:322-328.

［5］Heinecke JW.The HDL proteome:a marker-and perhaps mediator-of coronary artery disease.J Lipid Res，2009，50:S167-S171.

［6］Karlsson H，Leanderson P，Tagesson C，et al.LipoproteomicsⅡ:Mapping of proteins in high-density lipoprotein using two-dimensional gelelectrophoresis and mass spectrometry.Proteomics，2005，5:1431-1445.

［7］Berrougui H，Isabelle M，Cloutier M，et al.Age-related impairment of HDL-mediated cholesterol efflux.J Lipid Res，2007，48:328-336.

［8］Nourooz-Zadeh J，Tajaddini-Sarmadi J，Wolff SP.Measurement of plasma hydroperoxide concentrations by the ferrous oxidation-oxylenol orange assay in conjunction with triphenylphosphin.Anal Biochem，1994，220:403-409.

［9］Khera AV，Cuchel M，de la Llera-Moya M，et al.Cholesterol efflux capacity，high-density lipoprotein function，and atherosclerosis.N Engl J Med.2011，364:127-135.

［10］Alwaili K，Bailey D，Awan Z，et al.The HDL proteome in acute coronary syndromes shifts to an infl ammatory profl le.Biochim Biophys Acta.，2012，1821:405-415.

［11］严晓伟，包婺平.疾病状态下高密度脂蛋白的功能缺陷.中国循环杂志，2007，22:152-154.

［12］Patel PJ，Khera AV，Jafri K，et al.The Anti-Oxidative Capacity of High-Density Lipoprotein Is Reduced in Acute Coronary Syndrome But Not in Stable Coronary Artery Disease.JACC，58，2011:2068-2075.

［13］Singh IM，Shishehbor MH，Ansell BJ.High-density lipoprotein as a therapeutic target:a systematic review.JAMA，2007，298:786-98.

［14］Eren E，Yilmaz N，Aydin O，et al.High Density Lipoprotein and it’s Dysfunction.Open Biochem J，2012，6:78-93.

［15］Asztalos BF，Tani M，Schaefer EJ.Metabolic and functional relevance of HDL subspecies.Curr Opin Lipidol，2011，22，176-185.

［16］Movva R，Rader DJ.Laboratory Assessment of HDL Heterogeneity and Function.Clin Chem，2008，54，788-800.

［17］Gao X，Yuan S，Jayaraman S，et al.Differential stability of high-density lipoprotein subclasses:effects of particle size and protein composition.J Mol Biol，2009，387，628-638.