SNRPN基因rs220030位点的分型及甲基化亲缘相关性

李 辉 ，徐红梅 ，赵 赟 ，李备栩 ，周怀谷 ，赵子琴

（1.复旦大学上海医学院法医学系，上海 200032；2.法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室，上海 200083）

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）在人类基因组中的总数超过300万[1]，且遗传稳定性更高，在法医学领域可作为STR基因座的有力补充手段。印记基因是指亲缘依赖性单等位基因表达，即只有一个父源性或母源性等位基因表达，印记基因的表达不符合经典的孟德尔遗传定律，其表达与否取决于其亲代来源。DNA甲基化是基因印记的重要标志，DNA甲基化差异的区域被称为差异甲基化区域（differentially methylated region，DMR）。 Huang等[2]应用PIA法检测H19基因上游片段4个SNP位点，成功对父源和母源印记基因进行了判定，表明等位基因亲缘差异性DNA甲基化联合毗邻的SNP位点多态性在法医亲权鉴定中有良好的应用前景[3]。

rs220030位点位于小核核糖核蛋白多肽N基因（small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N，SNRPN）上游启动子区域，rs220030位点上游存在若干CpG，其邻近的rs220028已被证实可用于亲缘等位基因判定[4]。本研究先运用DGGE技术对97例上海地区汉族家系血样的rs220030位点进行定性分型，同时运用焦磷酸测序技术对其中的25例血液来源的家系样本的rs220030位点进行定量分型并加以比较，结合重亚硫酸盐修饰方法通过焦磷酸测序分析三联体家系样本rs220030位点上游CpG甲基化状态的关联性，判断rs220030是否可用于亲缘等位基因的判定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

9700型PCR扩增仪（美国AB公司），DCode通用突变检测系统（美国Bio-Rad公司），紫外凝胶成像仪（上海复日科技有限公司），PyroMark Q96 ID焦磷酸测序仪、QIAamp DNA Micro试剂盒、EpiTect Bisulfite试剂盒（德国QIAGEN公司），PCR扩增试剂盒（上海天根生化科技有限公司）。

1.2 样本及DNA提取

收集97例上海地区汉族人群家系血样（25例血液样本由瑞金医院提供，72例血痕样本由司法部司法鉴定科学技术研究所提供），其中有29个三联体家系样本和2个五代家系样本。运用QIAamp DNA Micro试剂盒提取DNA。

1.3 引物合成

根据GenBank序列资料提供的rs220030位点正反向序列信息，应用Primer Premier 5.0软件设计一对DGGE测序引物，由上海生工生物技术公司合成（表 1）。 应用 PyroMark Assay Design Software 2.0软件设计4对焦磷酸测序引物（1对用于SNP分型，3对用于检测rs220030上下游CpG甲基化状态），由上海英骏生物技术公司合成（表2）。

1.4 PCR扩增

DGGE的PCR反应体系为10μL：DNA模板4μL，正反向引物各0.5μL，PCR反应混合液5μL。扩增条件：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，35 个循环；95℃ 5min。

焦磷酸的 PCR 反应体系为 50 μL：H2O 34.8 μL，缓冲液 10μL，dNTP 1μL，P1 1μL，P2 1μL，DNA 模板 2 μL，Taq 酶 0.2 μL。 扩增条件：95℃ 5 min；95℃30s，53℃ 30s，72℃ 60s，38 个循环；72℃ 7min。

1.5 DGGE技术SNP分型

采用DGGE技术对97例家系样本rs220030位点进行分型，变性梯度凝胶由10%聚丙烯酰胺［V（丙烯酰胺）∶V（双丙烯酰胺）=37.5∶1］配制而成，变性剂含量梯度范围35%～65%，100%变性剂包含7 mol/L尿素、40%去离子甲酰胺，1×TBE作为电泳缓冲液加热到60℃，10μL PCR扩增产物与2μL 6×溴酚蓝二甲苯青上样缓冲液混匀后点样，电泳电压170V，电泳时间210min。电泳结束后，凝胶经EB染色30min后，用紫外凝胶成像仪观察结果。

1.6 焦磷酸测序技术SNP分型

采用焦磷酸测序技术对25例血液来源的家系样本rs220030位点进行分型，根据PyroMark AQ模式设计好程序并在试剂仓内加好程序给定剂量的反应酶底物和dNTP等试剂，并通过PyroMark AQ-SNP模式读取分析结果。

1.7 重亚硫酸盐修饰

随机选择2组血液来源的家系样本用EpiTect Bisulfite试剂盒进行重亚硫酸盐修饰。反应体系为140 μL（85 μL 亚硫酸盐混合液，35 μL DNA 保护缓冲液，20μL DNA模板），根据试剂盒说明书完成操作。

1.8 修饰后样本PCR扩增

扩增反应体系 50μL：H2O 34.8μL，缓冲液 10μL，dNTP 1μL，P1 1μL，P2 1μL，DNA 模板 2μL，Taq酶0.2μL。第一个CpG所在序列的反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，38 个循环；72℃ 7min。第二、三个CpG所在序列的反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 60s，38 个循环；72℃ 7min。

1.9 甲基化状态的焦磷酸测序分析

重亚硫酸盐修饰后样本经PCR扩增后上机检测，根据PyroMark CpG软件设计好程序，在试剂仓内加好程序给定剂量的所需反应酶底物和dNTP等试剂，并通过PyroMark CpG软件读取分析结果。

2 结 果

2.1 DGGE电泳结果

97例家系样本经DGGE技术检测，在电泳图谱中显示1条或4条清晰电泳谱带，1条谱带为纯合子（根据分子量大小，靠下的为C纯合子，靠上的为T纯合子），4条谱带为杂合子（2条为同源双链，2条为异源双链），部分样本结果见图1。97例家系样本基因分型结果为：C纯合子20例、T纯合子29例以及C/T杂合子48例。

图1 rs220030位点分型的DGGE电泳图谱

2.2 焦磷酸测序SNP分型结果

25例血液来源的家系样本经焦磷酸测序SNP分型，分型结果与DGGE分型结果一致，部分样本结果见图2。

2.3 焦磷酸测序分析rs220030位点上游CpG甲基化状态结果

2组家系样本（家系1、家系2）经过重亚硫酸盐修饰后，经焦磷酸测序分析，rs220030上游CpG甲基化状态结果见图3、表3。

图2 rs220030位点分型的焦磷酸测序SNP分型结果

图3 家系1母亲样本rs220030上游CpG甲基化状态

表3 家系样本rs220030上游甲基化状态（%）

3 讨 论

3.1 rs220030位点的DGGE技术SNP分型

变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术作为一种经典的电泳SNP分型技术，对于小规模、低通量的SNP分型或者突变检测中具有一定的实用性。DGGE是利用DNA片段双螺旋解链温度（Tm）的差异进行突变分析。DNA片段在变性梯度凝胶中电泳时，起初双螺旋DNA片段以恒定速率向前迁移，在抵达变性效果相当于其Tm值的变性剂浓度点时，双链DNA开始部分解链而呈分支状使其迁移速度极度减缓，几乎处于“停顿”状态。长度相同的DNA片段，即使仅存在单个碱基改变，也将影响邻近碱基间的相互作用，导致Tm值改变，从而使DNA片段在相同电泳时间内因不同位移而得以分离[5]。赵赟等[6]运用DGGE技术与TaqMan探针技术对100例上海汉族人群rs220030位点进行分型得出群体遗传学数据，证明该SNP位点满足法医亲权鉴定和个人识别的需要。本研究运用DGGE技术对97例家系样本进行rs220030位点分型，检测出1条电泳谱带的为纯合子（靠下的为C纯合子，靠上的为T纯合子），4条电泳谱带的为杂合子（2条为同源双链，2条为异源双链）。同时本研究在引物的5′端加入一段40 bp的GC-clamp序列可立刻提高其对单碱基突变的检测效率，与Sheffield等[7]得出相同结论。

3.2 焦磷酸测序技术SNP分型的优势

焦磷酸测序（pyrosequencing）是一种实用的短序列实时检测技术，能够准确定量检测出单个SNP位点的多态性[8]。在SNP分型上，DGGE技术存在操作过程繁琐、通量低、一次仅能检测十多个样本、变性梯度凝胶配制难度大等问题，而焦磷酸测序技术一次测序只需设计一对扩增引物和一个测序引物即可，不需要制胶、毛细管、荧光染料和同位素，易于构建标准化的操作流程进行大样本群体SNP分型，灵敏度高、准确性高、精确性好。与传统的直接测序法比较，焦磷酸测序技术可以读出引物结合以后的临近碱基，更有助于对小片段的精确定性，而传统的直接测序法在引物结合位置后的20个碱基左右通常不可读。本研究针对25例血液来源的家系样本进行焦磷酸测序，C纯合子结果为 C：100%，T：0%；T纯合子结果为 C：0%，T：100%；C/T杂合子结果为C和T百分比各占一半左右（C：58%，T：42%）。 结果与 DGGE 技术检测结果一致，但相比DGGE技术，进行焦磷酸测序操作过程简单直接，无需配制变性梯度凝胶，无需反复摸索电泳条件，并且在结果观察上，相比观察DGGE电泳谱带可能出现伪带的情况，焦磷酸测序结果更为直观。

3.3 焦磷酸测序技术分析CpG甲基化状态

应用焦磷酸测序对CpG甲基化状态进行分析，结合重亚硫酸盐修饰方法，用重亚硫酸盐将未甲基化的胞嘧啶（C）修饰为尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶保持不变，经过PCR扩增后，尿嘧啶（U）将变成胸腺嘧啶（T），由此单个CpG甲基化状态的分析就转化为普通SNP位点的C/T单碱基多态性分析，其中等位基因C的频率即为基因甲基化的程度，能够准确定量分析出待测基因的CpG甲基化状态[9]。本研究对经过重亚硫酸盐修饰的2组家系样本进行rs220030上游CpG甲基化状态进行分析，单个CpG等位基因C的频率即为该CpG上胞嘧啶甲基化程度，如家系1母亲样本3个CpG的C等位基因频率分别为66%、64%、55%，表示这3个CpG胞嘧啶的甲基化程度分别为66%、64%、55%。

3.4 rs220030位点上游CpG甲基化亲缘相关性

通常亲子鉴定中假设父不具备生父基因，即可排除亲子关系，但在某些情况下如母亲和孩子为相同基因型的杂合子时，则生父、生母基因无法确定。联合分析毗邻印记基因座的亲缘特异性甲基化标记和多态性遗传标记，可解决单亲家系亲代与子代为相同基因型的杂合子时，生父、生母基因无法确定的问题[10]。人类基因组中，CpG二核苷酸在基因启动子区和第一外显子区域等一些特定区域常成簇出现，形成CpG富集现象，称为CpG岛（CpG island），以往对亲缘差异性甲基化的研究主要集中在CpG岛。rs220030位于SNRPN基因上游启动子区域，Nakayashiki等[11]研究发现 5 个印记基因（H19、HYMAI、MEST、SNPRN、PEG）内有7个以上SNP可用于亲缘等位基因判定，其中的rs220028与rs220030毗邻，rs220030位点虽然不在CpG岛上，但rs220030与rs220028之间有3个散在的CpG。本研究应用焦磷酸测序技术对经过重亚硫酸盐修饰过的2组三联体家系样本rs220030上游CpG甲基化状态进行检测，分析其亲缘相关性，子代3个CpG的甲基化程度与母亲3个CpG的甲基化程度接近（表3），表明子代3个CpG的甲基化来源于母亲。从而说明了在启动子区域内CpG岛邻近的散在CpG也可能存在甲基化亲缘相关性，结合毗邻的SNP位点，有用于亲缘等位基因判定的可行性。

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