富勒烯（C60）对RNA逆转录的影响

李 佳，林 燕，陈敏杰，张 捷，李 正，梁 勇，3*

（1.江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056； 2.华中农业大学 资源与环境学院，湖北 武汉 430070；3.江汉大学 光电化学材料与器件省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430056）

0 引言

富勒烯及其衍生物的生物学效应以及在医学上的应用是目前富勒烯研究的热点领域。富勒烯的生物学及医学应用主要包括抗氧化剂［1］，抗病毒［2］，神经保护蛋白［3-4］，酶抑制剂［5-7］，抑制离子通道［8］，抑制淀粉样蛋白的形成［9］以及成像和核药物等。有研究表明，富勒烯衍生物可显著抑制HIV蛋白酶和HIV逆转录酶活性［2］，具有一定的临床应用价值。

但是，也有研究表明富勒烯及其衍生物可改变核酸、蛋白质、脂质等生物大分子的构象，影响其生物学功能，进而引发一系列生物学效应。如与核酸分子（DNA）相互作用，包括选择性剪切DNA双链［7］，并且在光催化条件下引起质粒DNA构象的改变［10-12］；与蛋白质和酶的相互作用，改变酶活性，进而显著性抑制多种酶活性，如Taq DNA聚合酶［13］、谷胱甘肽还原酶［6］、乙酰胆碱酯酶［14］、半胱氨酸蛋白酶（木瓜蛋白酶）和丝氨酸蛋白酶等（胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶和凝血酶等）等，同时也与其他蛋白质结合，如富勒烯特异结合的抗体蛋白［15］、人血清白蛋白、牛血清蛋白［16-18］和溶菌酶［19］；光催化引发细胞损伤和基因毒性等［20］。目前有些研究者认为，富勒烯及其衍生物对DNA损伤效应，主要与富勒烯产生的活性氧和自由基相关。富勒烯及其衍生物影响蛋白质或酶生物学功能，主要原因包括富勒烯及其衍生物与酶结合后，改变酶的空间构象，导致酶与底物无法结合；富勒烯及其衍生分子直接进入酶活性部位的腔体内，占据酶活性位点，阻碍底物的进入［21］；富勒烯及其衍生物结合到蛋白酶的亚基上，阻碍蛋白酶必需的功能性旋转运动，进而抑制酶活性［22］；富勒烯产生的活性氧和自由基攻击蛋白质或酶，破坏其空间结构，最终影响其生物学功能［5，23-24］。然而有关富勒烯与RNA相互作用的研究报道较少，有待进一步研究并阐明其相关作用机制，为富勒烯及其衍生物在医学临床上的应用提供实验依据。

RNA是一种生物大分子，它参与蛋白质合成和基因的表达调控，是细胞结构中生物遗传信息传递的重要中间载体。对于一部分病毒来说，RNA是唯一的遗传物质。它存在于细胞质和细胞核中，也存在于一些植物病毒和动物病毒以及噬菌体内。目前，国内外已有不少学者进行了靶向纳米材料作为siRNA载体的相关研究，颇有成效。Zhang等［25］合成-CONH-（CH2）6-NH3+Cl修饰的单壁碳纳米管（SWNT）复合物能够将siRNA转运到肿瘤细胞中，siRNA从SWNT的壁上脱离下来，用以沉默目标基因。Lu等［26］利用放射性同位素标记技术，发现SWNT可转移到MCF7乳腺癌细胞中。通过非特异性结合机制杂交的SWNT和RNA-poly（rU）聚合物，其中poly（rU）在运载过程中可从SWNT上解离下来；另外，通过对细胞生长活性MTS的检测，研究者发现SWNT对MCF7细胞具有一定毒性作用。因此，碳纳米材料进入细胞内，势必会与RNA相互作用，干扰正常的蛋白质合成以及基因的表达调控等，引起细胞代谢紊乱，进而引起基因毒性效应或细胞死亡。

逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）是在体外以mRNA为模版，以Oligo-dT为引物以及逆转录酶合成cDNA，并对某一特定DNA片段进行快速扩增的一种技术。本研究以RT-PCR为体外实验模型，研究富勒烯对RT反应的影响，旨在评估碳纳米材料对生物体产生毒性作用的分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料与试剂

试剂：C60购自ALDRICH公司（纯度为99.9%），Trizol购自Invitrogen，Carlsbad，CA；焦碳酸二乙酯购自DUCHAFA公司；乙醇、异丙醇和三氯甲烷为分析纯试剂，购自上海国药集团；引物Oligo-dT购自上海生工公司；M-MLV逆转录酶（200 U/μL）、dNTP购自Promega公司；溴化乙锭购自Fluka公司；琼脂糖（G-10）购自BIOWEST公司；2×Taq PCR Mastermix，DNA上样缓冲溶液、RNA上样缓冲溶液、DNA分子量标记Marker I均购自TIANGEN公司。

仪器：超声波仪（型号KQ-500B，昆山市超声仪器有限公司）；PCR仪（TC-312，TECHNE公司）；超纯水仪（BARNSTEAD NANOPURE，Thermo Scientific公司）；台式高速冷冻离心机（5417R，Eppendorf公司）；核酸测定仪（6361，Eppendorf公司）；水平电泳槽（型号为DYCP-31C，北京六一公司）；电泳仪（型号为DYY-5，北京六一公司）；凝胶成像仪（JD-801，江苏捷达科技公司）。

1.2 斑马鱼鱼肝RNA的提取

为了研究C60对RNA逆转录的影响，取斑马鱼幼鱼鱼肝匀浆后，用于制备总RNA，Trizol试剂用于提取总RNA。核酸测定仪测定总RNA的浓度及纯度，记录A260和A260/A280的比值。RNA提取后应立即做逆转录或放入冰箱-80℃保存。

1.3 C60对RNA逆转录的影响

为考察C60对逆转录（Reverse Transcription，RT）的影响，在20μL RT反应体系加入一定浓度C60。RT 反应体系：1μg RNA，2μL Oligo-dT，1μL不同浓度的C60，最后用DEPC水补齐总反应体系13μL，C60终浓度分别为10、50和100μg/mL。充分混匀后72℃反应5 min，冰上静置5 min。然后向PCR管中依次加入 3μL dNTP（5 mmol/L），1μL M-MLV 逆 转 录 酶 （200 U/μL），5μL RT-MLV Buffer（5×），最后用DEPC水补齐总反应体系25μL。RT反应条件：42℃反应1 h。

用软件primer premier 5.0设计斑马鱼看家基因β-actin引物，引物序列（上游引物：5’-CAACAGAGAGAAGATGACACAGATCA-3’；下游引物：5’-GTCACACCATCACCAGAGTCCATCAC-3’）。以cDNA为模板，β-actin为引物PCR，PCR体系：1μL cDNA，1μL上游引物（2μmol/L），1μL下游引物（2μmol/L），10μL 2×PCR SuperMix，最后用无菌水补齐总反应体系20μL。在对照组实验中，RT反应体系中不含C60，而在PCR反应体系中加入浓度 0.5、2.5 和 5μg/mL C60。PCR 条件：预变性 95℃/5 min，变性 94℃/10 s，退火55℃/10 s，延伸72℃/30 s，35个循环，再延伸72℃/5 min。

1.4 M-MLV逆转录酶的酶量对C60抑制RT的影响

为考察C60对M-MLV逆转录酶活性的影响，增加RT反应体系中M-MLV逆转录酶的含量，并加入 80μg/mL C60。RT反应体系：1μg RNA，2μL Oligo-dT，1μL 不同浓度的C60，最 后 用DEPC水补齐总反应体系13μL。充分混匀后离心，72℃反应5 min后，冰上静置5 min。向PCR管中依次加入 3μL dNTP（5 mmol/L），1、2或 4μL M-MLV逆转录酶（200 U/μL），5μL RT-MLV Buffer（5×），最后用 DEPC 水补齐总反应体系25μL。在对照组实验中，RT反应体系中添加不同含量的M-MLV逆转录酶。RT反应条件：42℃反应1 h。

以 cDNA为模板 PCR，PCR体系：1μL cDNA，1μL上游引物（2μmol/L），1μL下游引物（2μmol/L），10μL 2×Taq PCR MasterMix，最后用无菌水补齐总反应体系20μL。PCR条件：预变性95℃/5 min，变性94℃/10 s，退火55℃/10 s，延伸72℃/30 s，35个循环，再延伸72℃/5 min。PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 C60对RNA构象的影响

为了研究C60对RNA构象的影响，将所有孵育实验均避光进行，反应体系：1μL RNA，5或10μL C60，最后用DEPC H2O将体系补齐到20μL，C60终浓度为5、10和50μg/mL。混合均匀后，用封口膜将PCR管盖封好。放入37℃培养箱中反应12 h，孵育完成后立即使用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 琼脂糖凝胶电泳

称取0.4 g琼脂糖于锥形瓶中，加40 mL TAE（1×）缓冲液，电炉上加热沸腾两次后，取下冷却至50～60℃。加2μL EB（10 mg/mL），混匀，小心倒入胶槽，避免出现气泡，插上梳子，凝固后放入装有TAE电泳缓冲液的电泳槽内。将1μL溴酚蓝和5μL PCR产物充分混合后，小心加入点样孔内，电压100 V，电泳约30 min。电泳结束后用捷达凝胶成像系统采集照片，利用JD凝胶分析软件计算DNA条带光密度。

2 结果

2.1 C60对RNA RT反应的影响

在基因表达差异检测中，β-actin mRNA因其高丰度经常被作为一种内源性的标准，以判断每一样品中RNA的改变情况。本文以斑马鱼鱼肝mRNA为模板逆转录成cDNA，在RT反应体系中添加一定浓度的C60，研究C60对RNA逆转录的影响。实验结果显示，当PCR反应体系中不含C60时，琼脂糖凝胶电泳显示138 bp大小的PCR产物（图1，泳道1所示）。而在RT反应体系中加入C60的实验组（图1，泳道5、6和7），PCR产物生成受到明显抑制，并且C60对PCR产物的抑制作用具有浓度依赖性。另外，由于实验中RT体系中添加的富勒烯并没有去除，而是随cDNA带入到PCR体系中，于是在随后的PCR体系中添加富勒烯对照实验。通过计算，在RT体系中加入10、50和100μg/mL C60时，被带入PCR反应体系中的C60浓度依次为0.5、2.5和5μg/mL。本研究发现对照组（图1，泳道2、3和4）与阴性对照组（图1，泳道1）相比，PCR产物无明显差异。以上实验结果表明C60能够显著抑制RT反应且与C60浓度密切相关。

图1 C60对RNA RT反应的影响

2.2 C60对RNA构象的影响

为了进一步研究C60抑制RT反应的作用机制，本研究将C60与RNA在37℃下反应，探讨C60对RNA构象的影响，结果如图2所示。实验组与对照度相比，C60可显著降解28S rRNA，并且C60对RNA的损伤作用具有浓度依赖性。实验结果表明C60对RNA具有一定损伤作用，因此，在RT反应中，减少cDNA的合成量，最终导致PCR产物的减少。

图2 不同浓度C60在37℃避光条件下对RNA构象的影响

2.3 M-MLV逆转录酶的酶量对C60抑制RT的影响

为了探讨C60对RT抑制效应的作用机制，本研究设计了M-MLV逆转录酶的补偿实验，即在RT反应体系中添加100μg/mL C60的情况下，增大体系中M-MLV逆转录酶的酶量，观察逆转录酶是否能够逆转C60对RT的抑制作用，结果如图3所示。当体系中不含C60，M-MLV逆转录酶的酶量依次是200、400和600U时，可以观察到逆转录酶的酶量对PCR产物量没有明显影响（如图3中泳道1、2和3所示），而当反应体系中添加100μg/mL C60时，逆转录酶可以逆转C60对RT的抑制作用，并且随着M-MLV逆转录酶的酶量增加，PCR产物显著增加（图3中泳道5、6和7所示）。实验结果表明，C60可显著抑制M-MLV逆转录酶的活性，在RT反应中减少cDNA的合成量，最终导致PCR产物的减少。

图3 M-MLV逆转录酶的酶量对C60抑制RT的影响

3 讨论

M-MLV逆转录酶酶活性的大小主要取决于酶构象的稳定性，尤其是逆转录酶酶活性位点的构象。大量研究表明在光催化条件下，富勒烯衍生物可生成多种活性氧物质［11-12，27］，造成 DNA损伤和脂质过氧化，以及蛋白质构象的改变［16-18］。本研究发现C60在非光催化条件下，不仅可以抑制M-MLV逆转录酶的活性，同时也可显著降解28S rRNA，表明C60对RNA有一定损伤作用。C60抑制M-MLV逆转录酶酶活性下降，从而抑制RT反应，降低cDNA合成量，进而引起PCR产物显著下降。可能的解释有：C60与酶结合后，改变酶的空间构象，导致酶与底物无法结合；C60直接进入酶活性部位的腔体内，占据酶活性位点，阻碍底物的进入［21］；C60与酶的亚基结合后，阻碍蛋白酶必需的功能性旋转运动，进而抑制酶活性［22］；C60产生的活性氧和自由基直接攻击蛋白质或酶，破坏其空间结构，最终影响其生物学功能［5，23-24］。

C60不仅可与M-MLV逆转录酶相互作用，同时也可显著降解28S rRNA，表明C60对RNA构象的影响具有空间结构特异性。可能的解释是：C60可能与28S rRNA相互作用，改变RNA构象，造成RNA构象不稳定，致使RNA断裂；在RT的反应过程中，由于C60特殊的表面特性，它可在RT反应中生成多种活性氧物质或自由基，ROS攻击RNA，造成RNA的损伤。

另外，在RT反应过程中，由于C60的小尺寸效应，有可能阻碍M-MLV逆转录酶与mRNA的结合，干扰Oligo-dT与mRNA的结合，干扰dA、dT、dG和dC在RNA在逆转录过程中的延伸反应，降低RT反应效率，在较高C60浓度作用下，完全抑制RT反应。

本研究中利用mRNA体外逆转录实验结果证实，C60可以抑制M-MLV逆转录酶酶活性，同时对RNA有一定损伤作用，说明C60存在一定的基因毒性。但是本研究体系相对简单，相比生物体内复杂的微环境，缺少反馈和修复机制等。因此，应该利用多种模型进行生物活体实验，更进一步研究C60对生物体的毒性效应并深入探讨其潜在的致毒机制。同时，C60及其衍生物应用到临床医学领域，应当重视富勒烯和其他碳纳米材料的潜在毒性效应。

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