CTMAB催化增敏分光光度法测定食品中的己烯雌酚

陈荷莲，黄 璐，郑 琦

（江汉大学 化学与环境工程学院，湖北 武汉 430056）

己烯雌酚（DES）［1］是一种人工合成的非甾体雌激素类物质，药理性质与天然雌二醇相似，具有促进蛋白质合成，增加蛋白质沉积，减少脂肪沉积等功效；它能促进畜牧动物生长、增加瘦肉率、提高肉料比等。但实践表明，DES对人体具有很强的毒副作用，如改变机体遗传物质，导致基因突变，促使细胞癌变。因此，自1979年起包括我国在内的世界各国开始严格控制DES作为治疗药物的使用，并禁止用作动物饲料添加剂。但由于利益的驱动，一些不法商人仍然违规滥用。为保护人类健康，动物性食品中DES残留的检测显得尤为重要，文献报道的DES检测方法主要有：高效液相色谱法、气相色谱法、色谱-质谱联用法［2-4］、酶联免疫分析法、电化学法等［5］，这些方法要么对仪器要求较高，要么对试剂要求较高，其推广和应用受到一定限制。笔者利用DES具有还原性特性，探索了由三甲基十六烷基溴化铵（CTMAB）、Fe（Ⅱ）、K3［Fe（CN）6］等组成的多元络合体系［6］为探针的用可见分光光度法测试DES的新方法。该方法所要求仪器普通，试剂常规，一般实验室条件都能满足。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

DES，阿拉丁试剂公司，99%标准品；乙腈，国药集团化学试剂有限公司，AR；HCl，信阳市化学试剂厂，AR；NaOH，天津市大陆化学试剂厂，AR；CTMAB，BDH Chemicals Ltd.Poole（Eng⁃land），98%标准品；K3［Fe（CN）6］、FeCl3，天津市福晨化学试剂厂，AR；配溶液所用水为二次蒸馏水；奶粉，购自超市。

BF-2000型N2吹干仪，北京八方世纪有限公司；UV-2550双光束紫外可见分光光度计，日本岛津公司；800型低速离心沉淀机、HH-2数显性恒温水浴锅，国华仪器；电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；Q-250超声波提取仪，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法与步骤

1.2.1 溶液配制 DES储备液：电子天平准确称量0.0514 g的DES，用乙腈溶解并稀释至50 mL，得浓度为1.0177 mg/mL的标准储备液。实验时用乙腈稀释至8.14 μg/mL。

FeCl3溶液：准确称取1.0100 g FeCl3，蒸馏水溶解并稀释至250 mL，其间用浓HCl调溶液pH在1.0～1.5之间，得浓度为1.5×10-2mol/L储备液。实验时用蒸馏水稀释到所需浓度。

K3［Fe（CN）6］溶液：准确称取1.2300 g K3［Fe（CN）6］，用蒸馏水溶解并稀释至250 mL，得浓度为1.5×10-2mol/L储备液。实验时用蒸馏水稀释到所需浓度。

CTMAB溶液：用电子天平准确称量0.1016 g CTMAB，用蒸馏水溶解并稀释至100 mL，得浓度为2.79×10-3mol/L CTMAB溶液。

1.2.2 实验方法 准确移取1.5×10-3mol/L FeCl3溶液2.0 mL和CTMAB 200 μL于10 mL比色管中，摇匀；在10 min内分批加入适量的DES标准溶液或试样溶液，用HCl调pH值到3.0，30℃下反应10 min；最后加入1.5×10-3mol/L K［3Fe（CN）6］溶液2.0 mL，摇匀，40℃下反应40 min；用二次蒸馏水定容到10 mL，摇匀，以试剂空白为参比，用2 cm的比色皿于736 nm处测定其吸光度［1］。

2 结果与分析

2.1 吸收光谱

按1.2.2实验方法配制溶液绘制其吸收光谱，以乙腈为参比测得DES溶液吸收光谱，以水为参比测得FeCl3溶液、K3［Fe（CN）6］溶液吸收光谱，以试剂空白为参比，测得反应生成的多元络合物的吸收光谱，扫描区间在300～900 nm（图1）。

图1 物质吸收光谱

如图1所示，DES、FeCl3和K3［Fe（CN）6］在可见光区几乎没有吸收，反应生成的多元络合体系在700～800 nm范围内有明显吸收，体系的最大吸收波长在736 nm处，故选择测定吸光度的波长为736 nm。

2.2 条件的选择

2.2.1 酸碱度的影响 按实验1.2.2的方法，在加入DES后调节体系的pH值分别为1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0，试剂空白做参比，测吸光度值（表1）。

由表1可知，pH值为3.0时有最大的吸光度值，故加入DES后调整体系pH值为3.0。分析原因：当体系pH值超过3.0时，溶液中的Fe（Ⅲ）以Fe（OH）3沉淀析出，残存于体系中Fe（Ⅲ）太少，影响了与DES的反应，pH值为3.0时能保证体系中的Fe（Ⅲ）浓度最高，与DES的相互作用更充分、完全，为后续的络合体系提供更多Fe（Ⅱ）。

2.2.2 反应时间 依据1.2.2的实验步骤，FeCl3溶液中加入一定量DES后，控制反应时间分别为10、20、30、50 min，然后加入K［3Fe（CN）6］溶液，反应40 min，试剂空白做参比，测吸光度（图2）。

图2 时间对吸光度的影响

由图2可见，随着反应时间的延长，测得的吸光度减小，反应时间为10 min有最大的吸光度，故加入DES后反应时间定为10 min。

同样方法，改变加入K［3Fe（CN）6］溶液后的反应时间，结果表明，反应时间为40 min有最大吸光度，故反应时间定为40 min。

2.2.3 反应温度的影响 依据1.2.2的实验步骤，考察了温度对体系吸光度的影响。FeCl3溶液中加入一定量DES后，控制反应温度分别为30℃（室温）、40℃、50℃、60℃，反应10 min，然后加入K［3Fe（CN）6］溶液，反应40 min，后用试剂空白做参比，测吸光度（图3）。

图3 体系反应温度对吸光度的影响

由图3可知，随温度的升高测得的A值减小，温度为30℃时有最大的吸光度，故实验时加入DES后反应时的温度定为30℃。

同样方法，改变加入K3［Fe（CN）6］溶液后的反应的温度，结果表明，温度为40℃时有最大的吸光度，故反应温度定为40℃。

2.2.4 FeCl3、K3［Fe（CN）6］溶液用量的影响依据1.2.2的实验步骤，考察了FeCl3用量对体系吸光度的影响。固定 DES、CTMAB、K3［Fe（CN）6］溶液用量，改变FeCl3用量，设定FeCl3溶液的加入量为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、3.0 mL，试剂空白做参比，在选定波长下测吸光度，其结果如图4。

图4 FeCl3溶液用量对吸光度的影响

如图4所示，当FeCl3加入量小于2 mL时，随着FeCl3加入量增加，吸光度逐渐增大，超过2 mL后吸光度随FeCl3加入量增大而减小，因此实验中将FeCl3溶液用量定为2.0 mL。

同样方法只改变K［3Fe（CN）6］用量，固定其他各试剂加入量不变，K［3Fe（CN）6］溶液加入量为2.0 mL时有最大的吸光度，因此实验中K［3Fe（CN）6］溶液用量定为2.0 mL。

2.2.5 CTMAB用量和加入顺序的影响 按照1.2.2实验方法，考察了CTMAB加入量对体系吸光度的影响。固定DES、FeCl3、K［3Fe（CN）6］溶液用量，改变CTMAB用量，设定CTMAB溶液的加入量为0、100、200、400、600 μL，试剂空白做参比，在选定波长下测吸光度（图5）。

如图5所示，体系加入CTMAB后吸光度增大，且最大吸收波长发生红移。当CTMAB溶液加入量大于100 μL后，体系的吸光度没有明显的增大，加入量在200～400 μL之间体系的吸光度和红移值几乎相同没有明显变化，当加入量到600 μL时，吸光度明显降低，因此实验中TMAB溶液用量定为200 μL。

图5 CTMAB用量对吸光度的影响

CTMAB在本体系中起着增溶增敏作用，其机理是：①表面活性剂的阳离子和显色剂的络阴离子形成离子对，会形成长链铵胶束，增加其离解度，使溶液最大吸收红移。②季铵盐胶束的形成可起分散剂的作用，使这些离子对发生胶束增溶作用，使较多的显色络合物质点保持在水相，同时使光的吸收增大。③季铵盐的存在，使金属和有机配位体形成高配位数的络合物，灵敏度增加。

依据1.2.2实验方法，固定DES、CTMAB、FeCl3、K3［Fe（CN）6］溶液用量不变，改变各溶液加入的先后顺序，测体系摩尔吸光系数ε值。分别以如下的各试剂加入先后顺序做实验：

实验表明，（1）的ε值最大，至少是其他组的1.2倍，故各试剂加入先后顺序应按（1）的顺序加。CTMAB在（1）中能使FeCl3与DES之间的相互接触更充分，反应更完全，具有相转移催化作用。

2.3 标准曲线和检出限

依据1.2.2实验方法，准确加入不同体积的DES，绘制标准曲线（见图6）。

图6 标准曲线

DES的质量浓度在0.03256～0.6521 μg/mL范围内符合比尔定律，线性回归方程为A=0.0027+0.3990 ρ（μg/mL），相关系数R2=0.9991。

根据线性回归方程计算出DES摩尔吸光系数ε=5.43×105L/（mol·cm）。根据实验步骤，平行测定11份空白溶液，按照空白测得值的标准偏差的3倍除以工作曲线拟合方程斜率，求出其检出限为1.35 mg/L，相对标准偏差0.89%。

2.4 样品分析

准确称取2.0 g奶粉试样于10 mL具塞刻度离心管中，加4.0 mL乙腈混匀，超声提取20 min，后以4000 r/min离心10 min，取上清液静置，重复3次，合并上清液，40℃下用N2吹干，残余物用乙腈溶解并定容至2 mL，用于实验检测。

用空白奶粉试样进行添加回收实验，精密称取样品2.0 g，添加浓度为1.5 μg/mL DES标准液。按1.2.2实验方法测定空白和加标样品在736 nm处的吸光度，计算其回收率。测3次取平均值，回收率在89.3%～101.6%。

3 结论

利用DES具有将Fe（Ⅲ）还原成Fe（Ⅱ）的特性，探索了由CTMAB、Fe（Ⅱ）、K3［Fe（CN）6］等组成的多元络合体系为探针的可见分光光度法测试DES的新方法。实验表明DES的质量浓度在0.03256～0.6521 μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系，线性回归方程 A=0.0027+0.3990ρ（μg/mL），相关系数R2=0.9991，摩尔吸光系数ε=5.43×105L/（mol·cm）。CTMAB在该分析方法中具有催化和增敏作用。在对奶粉样品的加标实验中，回收率为89.3%～101.6%。

［1］罗板鑫，陈昌云.一种简单快速的己烯雌酚定性检测方法研究［J］.中国教育技术装备，2012（6）：126-127.

［2］杜志峰，黄金凤.动物肌肉组织中己烯雌酚残留量的液相色谱-串联质谱法测定［J］.分析测试学报，2007，26（6）：823-826.

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［4］潘自红，马丹丹，李子贺，等.FeCl3-铁氰化钾体系分光光度法测定酚磺乙胺［J］.分析试验室，2013，32（1）：111-113.

［5］王瑶，周建华.食品中己烯雌酚的检测方法［J］.食品工业科技，2012，2（33）：373-375.

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