吡嗪酰胺每日一次与三次给药在小鼠体内的药代动力学比较及其对异烟肼-利福平的影响

2013-05-14 06:02朱慧王彬付雷刘诚诚陆宇
中国防痨杂志 2013年12期
关键词:药代吡嗪异烟肼

朱慧 王彬 付雷 刘诚诚 陆宇

结核病是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病,每年约有新发患者800万例,200万例死于结核病[1]。抗结核药物一般联合应用,以应对结核分枝杆菌各亚群。吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)是合成的烟酰胺的类似物,在单独给药时,杀菌活性很弱,但与利福平及几种新药合用时,有显著的协同效应[2]。作为WHO和国际防痨与肺部疾病联合会(IUATLD)推荐的6种主要抗结核药物之一,DOTS方案中添加PZA可以缩短疗程并降低结核病复发率[3-4]。

吡嗪酰胺在每日给药及间歇给药方案中所用剂量是不同的。WHO推荐剂量是:1次/d给药,15~30 mg/kg;间歇用药时,3次/d给药,25~35 mg/kg[5-7]。然而,在中国大部分地区,吡嗪酰胺的给药方式是2~3次/d[8-9]。国内的一些医生已经注意到不同地区吡嗪酰胺给药频率的不同[10-11],建议通过大规模临床试验评价1次/d给药和3次/d给药的效果,以规范吡嗪酰胺的合理有效应用。

相比于每天数次给药,1次/d的给药方式通常认为可以提高患者的依从性。然而,在国内,吡嗪酰胺的耐受性问题使得普遍采用3次/d的给药方式。本研究在小鼠模型上比较吡嗪酰胺1次/d给药和3次/d给药的药代动力学差别,为临床应用提供依据。

材料和方法

一、实验材料和仪器设备

1.实验用鼠来源:150只雄性BALB/c小鼠,平均体质量(18±2)g,小鼠均为6周龄,购于维通利华实验动物技术公司,所有动物实验符合动物伦理学要求。

2.实验所用试剂:药物标准品异烟肼(INH,产品编号:117k0719)、利福平(RFP,产品编号: 1000948933)、吡嗪酰胺(PZA,产品编号:157640250)均购于Sigma公司。药物均为粉末状,-20 ℃冰箱保存,临用前溶于5%羧甲基纤维素钠溶液中给小鼠灌胃。

安捷伦高压液相系统(安捷伦公司,美国)配备G1329A ALS模块和柱加热器(G1316A),6410B三重串联四级杆质谱,电喷雾电离质谱源(ESI),数据采集及处理软件G3335AA-MASSHUNTER_ software-78。

二、实验方法

1.设计和分组: 150只小鼠按编号法随机分为5组(表1)。每组30只,灌胃给药(给药前小鼠禁食以避免食物干扰)。组1给予吡嗪酰胺1次/d,组2给予吡嗪酰胺3次/d,组3给予异烟肼和利福平,组4和5同时给予吡嗪酰胺、异烟肼和利福平(组3给予异烟肼和利福平1次/d,组4给予吡嗪酰胺、异烟肼和利福平1次/d,组5给予吡嗪酰胺3次/d、异烟肼和利福平1次/d,具体见表1)。3种药物剂量均按人体剂量换算后,对应的小鼠剂量为异烟肼25 mg/kg,利福平20 mg/kg,吡嗪酰胺150 mg/kg(实验设计以1 d药物总剂量相同为前提)。

2.小鼠血样品的留取和处理:小鼠给予6个药物剂量(即给药6 d后)后24 h,每组取3只小鼠(由操作者在各组内按编号法随机抓取3只血样作为0 h 样品;给予第7次剂量(按表1给药,即第7天给药之后取血)后每组3只小鼠在0.25、0.5、1、2、4、6、8 h分别眼眶取血作为各时间点样品。血样前处理方法简述如下:50 μl血清样品加入100 μl乙腈沉淀蛋白,混合后涡旋振荡器振荡20 s,离心(13 000×g,10 min)。取100 μl上清液,37 ℃吹氮气干燥(氮气干燥仪),再加入200 μl流动相(流动相在液质联用检测部分有详细说明,因为检测不同药物时有不同流动相配比,此处用流动相泛指,检测时按体积配比,不需测定pH值)溶解。

表1 各组小鼠实验给药剂量与给药频次

注“-”:此组小鼠不使用此药物;实验设计以1 d药物总剂量相同为前提

小鼠灌胃给药6个剂量后,每组3只小鼠在0.25、0.5、1、2、4、6、8 h取血,检测血药浓度;图中每点表示3只小鼠血药浓度的分别代表组1、组2、组4和组5中的吡嗪酰胺浓度图1 吡嗪酰胺单用(组1、2)或联合异烟肼-利福平(组4、5)给药时吡嗪酰胺在小鼠体内的AUC

小鼠肺样本的留取和处理:小鼠给予6个药物剂量后24 h,每组3只小鼠眼眶取血后,解剖,肺组织匀浆作为0 h样品;给予第7次剂量后每组3只小鼠在0.5、2、4 h分别取肺作为各时间点样品。肺样本处理:全肺称重后,加入甲醇用匀浆机匀浆,离心(13 000×g,10 min)取上清。液相色谱-质谱联合检测肺样本方法和血样基本一致。

3.液相色谱-质谱联合检测药物浓度:吡嗪酰胺和异烟肼的浓度检测使用色谱柱ZORBAX SB-aq (2.1 mm×100 mm),利福平的浓度检测使用ZORBAX SB C-18 (2.1 mm×50 mm)柱,柱温25 ℃。流动相A为含0.1%甲酸和5 mmol甲酸胺的去离子水溶液,流动相B为100%纯乙腈,流动相C为含0.1%甲酸的去离子水溶液。检测吡嗪酰胺和异烟肼时使用体积百分比为92%的A和8%的B为流动相,利福平使用体积百分比为60%的B和40%的C为流动相,流率0.3 ml/min。进样量2 μl。多重离子监测(MRM)分别为,PZA:124.1→81.1质荷比(m/z);INH:138.2→121.0 m/z;RFP:823.2→791.3 m/z。

用去离子水配制吡嗪酰胺1 mg/ml和异烟肼0.4 mg/ml储备液,利福平溶于50%甲醇水溶液中配制成0.4 mg/ml储备液。用去离子水配制的已知浓度的标准药物溶液,通过在空白血清中加入不同体积的药物标准溶液,得到同时含有吡嗪酰胺和异烟肼的不同溶液,吡嗪酰胺/异烟肼分别为10/0.1、20/0.2、40/1.0、50/2.0、100/4.0、200/10 μg/ml(10/0.1是指1份同时含有10 μg/ml吡嗪酰胺和0.1 μg/ml异烟肼的小鼠血清样品,其他以此类推),利福平为0.2、0.4、1、4、10、20、28 μg/ml,通过液相色谱-质谱联用仪器检测,以峰面积为纵坐标,药物浓度为横坐标,绘制标准曲线。方法有效性及特异性已检测[12],空白血清无干扰,线性范围[12]分别为利福平0.1~40 μg/ml (r2=0.999), 异烟肼0.1~10 μg/ml (r2=0.998),吡嗪酰胺0.1~10 μg/ml (r2=0.999), 10~200 μg/ml (r2=0.995)。

4.质量控制:具体方法的精密度、重现性等方法学已经考证[13],空白血样采自未给药小鼠,同一小鼠血样分2份,一份检测利福平,另一份同时检测吡嗪酰胺和异烟肼。

三、结果的判读和统计学处理

结 果

1.不同给药方式中吡嗪酰胺的主要药代动力学参数:如图1所示,小鼠灌胃单独给予吡嗪酰胺后,1次/d给药时平均峰浓度Cmax为(155.3±5.1)μg/ml,3次/d给药时为(43.2±2.6)μg/ml;相应的8 h内药时曲线下面积AUC0~8 h值分别为269.5和70.9 mg·h/L。当同时给予异烟肼和利福平时,吡嗪酰胺平均峰浓度Cmax1次/d给药时为(151.8±17.3)μg/ml,3次/d给药时为(45.1±1.0)μg/ml;相应的AUC0~8 h值分别为383.1和81.0 mg·h/L(表2)。图1显示了无论联用异烟肼-利福平与否,吡嗪酰胺的Cmax及AUC0~8 h值在1次/d给药时明显高于3次/d的给药,组1与组2(t=27.71,P<0.01);组4与组5(t=8.718,P<0.05)。

表2 吡嗪酰胺、利福平和异烟肼的药代动力学参数

小鼠灌胃给药6个剂量后,每组3只小鼠在0.25、0.5、1、2、4、6、8 h取血,检测异烟肼血药浓度;图中每点表示3只小鼠血药浓度的分别代表组3、组4和组5中的异烟肼浓度图2 异烟肼-利福平合用(组3)或联合吡嗪酰胺(组4、5)给药时异烟肼在小鼠体内的AUC

2.吡嗪酰胺不同给药方式时利福平的药代动力学参数变化:当利福平-异烟肼与150 mg/kg吡嗪酰胺联用时,对比于组3,吡嗪酰胺1次/d时(组4)轻微升高利福平的Cmax,降低Tmax和T1/2,AUC0~8 h无变化;吡嗪酰胺3次/d时(组5)则显著降低利福平的Cmax(t=6.181,P<0.05),Tmax和AUC0~8 h,升高T1/2(表2)。

3.吡嗪酰胺不同给药方式时异烟肼的药代动力学参数变化:当异烟肼、利福平和吡嗪酰胺三药联用时,吡嗪酰胺1次/d给药方案并不影响异烟肼的Cmax, T1/2(半衰期)和AUC0~8 h(组3),但吡嗪酰胺3次/d给药时(组5)则显著降低了异烟肼的Cmax和AUC0~8 h(相比于组3,Cmax组间t检验,t=9.499,P<0.01),同时使异烟肼的Tmax从0.25 h延长到0.5 h(图2,表2)。

4.小鼠肺中药物浓度:小鼠给药0.5、2、4 h后检测小鼠肺内异烟肼、利福平和吡嗪酰胺的浓度。对于吡嗪酰胺,四组小鼠肺组织浓度(μg/g)和血清药物浓度(μg/ml)均近似。异烟肼肺浓度(组3、4)为相同时间点血药浓度的1/2,而组5中异烟肼肺浓度极低而检测不到。三组小鼠中利福平肺浓度为相同时间点血药浓度的1/3~1/4(表3)。

表3 不同组别的3种药物在肺组织和血中不同时间点的浓度

讨 论

本研究在小鼠体内进行了吡嗪酰胺1次/d和3次/d给药的药代动力学比较,所用异烟肼、利福平和吡嗪酰胺的剂量相当于人体内同等剂量[7]。结果表明,无论是否联用利福平和异烟肼,PZA的Cmax和AUC0~8 h在1次/d给药方案中至少是3次/d给药时的3.5倍。正如Hall等[14]提到,吡嗪酰胺是AUC∶MIC比例驱动抗生素,AUC在吡嗪酰胺的抗结核效果中是一项重要的参数。基于此点,吡嗪酰胺1次/d给药方案优于3次/d。与异烟肼、利福平联用时,吡嗪酰胺3次/d给药降低了异烟肼、利福平的Cmax及AUC0~8 h,1次/d给药则没有,这表明当与异烟肼、利福平联用时,吡嗪酰胺3次/d给药会对异烟肼、利福平在药代动力学上产生拮抗效应,尤其是对异烟肼,而这是在抗结核治疗中不希望看到的。Grosset等[15]的研究也表明,小鼠体内,异烟肼和吡嗪酰胺-利福平存在拮抗作用,机理尚不清楚。

部分国内医生认为,吡嗪酰胺1次/d给药可能会引起更多的肝毒性。但迄今为止,并没有科学研究报告支持这一说法。根据Sharma等[16]的研究,吡嗪酰胺给药方案和肝毒性之间并无相关性。吡嗪酰胺在25 mg·kg-1·d-1或更低剂量时,并不产生相关的肝毒性,在20世纪50年代开始应用吡嗪酰胺时有较高的肝毒性(11%~14%)报告,但当时吡嗪酰胺每日剂量达40~70 mg/kg[12]。由于肝毒性的产生是药物蓄积的过程,在本实验中,未能同时检测肝毒性。

吡嗪酰胺在治疗初期的开始2个月可以杀死缓慢生长的结核分枝杆菌,是对抗持留菌最有效的药物[17]。近期国内对345例复治肺结核患者进行化疗方案比较时,化疗新方案及原方案中均含有吡嗪酰胺[18]。初始治疗阶段吡嗪酰胺推荐剂量是15~30 mg/kg (最大不超过2 g),而国内大部分给药方案是500 mg/次,3次/d,本研究至少在药代动力学方面并不支持这一方案。

相关PK-PD研究早已表明药物不同剂量及给药方案可以优化治疗及缩短疗程,通过调整给药方案可以更好地升高血药浓度达到药物治疗范围。通过针对个体体质量优化剂量可以达到疗效最大化及毒性最小化。建议对于可耐受的患者给予吡嗪酰胺1次/d方案。限于本研究仅从药代动力学的角度以及给药方案的局限和实验规模,还需要从药效学方面进一步寻找吡嗪酰胺1次/d和3次/d给药的依据,以期能够为更加合理地应用吡嗪酰胺提供理论依据。

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