高效液相色谱法测定决明子中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量

林炳国

佛山市中医院，广东佛山 528000

决明子主要为豆科绝命属植物决明（Cassia obtusifolia1.）或者是小决明（Cassia tora L.）的干燥的成熟种子，性味甘、苦、咸、微寒。临床上具有清热明目、润肠通便的效果，是中药方中常用的中药，其中的大黄素、大黄酚以及大黄素甲醚、芦荟大黄素等是决明子中的有效成分。文献中多报道关于决明子中总蒽醌含量的报道[1]，因此，本文采用了高效液相色谱法测定大黄素、大黄酚以及大黄素甲醚的含量，为决明子质量控制提供新的测定方法。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器

采用Water717高效液相色谱仪器，Water717可见-紫外检测仪器，Water717色谱处理机器，Water717自动进样器，梅特勒电子分析天平。

1.2 试药

大黄素（批号：20110201）、大黄酚（批号：20100928）、大黄素甲醚（批号：20101102）对照品购于中国药品生物制品检定所。中药决明子有我省中药研究所采购批发站提供，经鉴定为C.obtusifolia L.和C.tora L.的种子。

2 测定方法与结果

2.1 色谱条件的选择

色谱柱为NovapakC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，2.5 μm），流动相为甲醇：1.0%磷酸缓冲溶液（80:20），柱温：25℃，检测波长：254 nm，，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL。

2.2 标准曲线

精密称定大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品1.96 mg、3.57 mg、3.955 mg，放置于50 mL的容量瓶中，甲醇进行定容，摇匀后静置，后用甲醇再加至刻度。放置于4℃的冰箱中储存，备用。分别精密吸取大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品溶液20 μL，分别进样4次，测定三种成分的色谱峰面积，以进样量为横坐标，色谱峰面积作为纵坐标，经过绘图后得线性回归方程：大黄素Y=17.689×105X-0.069×105，r=0.9998；大黄酚Y=32.67×105X-0.099×105，r=0.9995；大黄素甲醚Y=9.874×105X-0.021×105，分别在1.96～19.6 μg/mL（r=0.9998），3.57～35.7μg/mL（r=0.9995），3.955～39.55μg/mL（r=0.9997）范围内线性关系良好。

表1 中药决明子中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量（1.0g）

2.3 样品测定

精密称取三个批次（20090201，20090827，20100122）中药决明子粉末1.5 g，过45目筛，采用甲醇回流提取，直至液体颜色变为无色，收集提取液放置于90℃水浴中蒸干，加入3.0 mol/L的硫酸溶液25 mol，直火缓缓回流2.0 h，后常温下放置，加入氯仿溶液40 mL，水浴回流提取1.0h，放冷，将提取液移至分液漏斗中，漏斗采用氯仿进行洗涤，分别取氯仿液，酸水层采用氯仿进行萃取，共计萃取5次，合并氯仿溶液，放置水浴上蒸干，残渣加入适量甲醇进行溶解，移至30 mL容量瓶中，甲醇定容，0.5 μm微孔滤膜过滤器过滤。分别进样20 μL，测定峰面积，根据线性关系方程计算大黄素、大黄酚以及大黄素甲醚的含量。结果见表1。

2.4 加样回收率试验

精密称取中药决明子药材5份，每份约为1.0 g，进行精密称定后，分别精密加入大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品30 mL。对照品按照对照品溶液的制备方法进行配置成供试品溶液，精密吸取上述溶液20 μL，按照2.1项下的色谱条件进行测定。测定各个成分的平均回收率。结果见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对进样后的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚进行全波长的扫描[2]，结果在254 nm处，三种成分有最佳的波长吸收，因此在实验过程中选定高效液相的检测波长为254 nm。

3.2 流动相的选择

根据相关资料中的检测结果，本文在试验过程中选择了几种不同系统的流动相[3-4]，如甲醇：0.1%磷酸缓冲溶液、甲醇：水系统、甲醇：1.0磷酸缓冲溶液，结果表明了以甲醇：1.0%磷酸缓冲溶液（80:20）时，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的分离效果及色谱峰峰形为最好，采用的1.0%磷酸缓冲溶液可以有效的抑制结构中酚羟基的解离，因此本次试验中采用甲醇：1.0%磷酸缓冲溶液作为流动相。

表2 大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的回收率测定结果（n=5）

实验结果表明，采用高效液相色谱法对中药决明子中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量进行测定分析，该方法简单、准确、分离度较好，可以作为中药决明子及其相关制剂的质量控制标准。

[1] 廖海，周嘉裕，何成生，等.决明子大黄素和大黄酚的提取与含量测定[J].时珍国医国药，2007，18（6）：1332-1334.

[2] 王宾豪，杨荣平，张小梅，等.高效液相色谱法测定决明子中蒽醌类成分的含量[J].时珍国医国药，2008，19（1）：135-137.

[3] 潘馨.气相色谱法测定绿衣枳壳中柠檬烯的含量[J].海峡药学，2006，24（2）：68-69.

[4] 潘馨.HPLC测定决明子中大黄素的含量[J].福建中医学院学报，2007，16（1）：40-45.