永川豆豉制曲过程中基本成分及生物胺含量变化*

胡鹏，胡国洲，陈光静，索化夷，阚建全，2，3

1(西南大学食品科学学院，重庆，400715)2(重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆，400715)3(农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆)，重庆，400715)

生物胺是一类具有生物活性的低分子量含氮有机化合物，食品中的生物胺主要由微生物氨基酸脱羧酶对氨基酸进行脱羧作用而形成［1］。生物胺是动物、植物和多数微生物体内的生理物质，适量的生物胺具有促进生长、增强代谢活力、加强肠道免疫系统、控制血压和消除自由基等生理功能［2］。但是高浓度的生物胺会严重影响食品风味甚至改变其成分，还会对人体产生毒害作用，造成人体神经系统和心血管系统损伤。可能含有高浓度生物胺的食品包括:易被微生物侵染的肉制品、鱼类、奶酪、发酵饮料、发酵肉制品和发酵豆制品［3－5］。由于生物胺具有潜在的毒性，目前食品中的生物胺已成为研究的热点问题。

豆豉具有较高的食用价值和一定的药理作用，是广大人民喜爱的佐餐佳品［6］。永川豆豉是中国豆豉四大品系中毛霉型豆豉的代表产品。随着对食品安全重视程度的增加，生物胺在中外传统发酵食品中含量也越来越受到关注，但是有关豆豉中生物胺的研究目前还缺乏。目前建立的生物胺分析方法主要有:薄层色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法、高效液相色谱法、氨基酸分析法［7］。本课题主要研究永川豆豉制曲过程中生物胺的种类和含量的变化，并同时跟踪研究在制曲过程中水分、总酸和氨基酸态氮等基本成分的变化，以期对永川豆豉制曲成熟及豉曲的品质及安全控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用实验原料为永川豆豉食品有限公司经天然制曲，取自处于不同制曲时间的永川毛霉型豆豉。原料大豆产地黑龙江省。

腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、2－苯乙胺、组胺、酪胺、苯甲酰氯 (纯度98%以上)，美国Sigma公司;甲醇(色谱级)，天津四友精细化工厂;高氯酸(分析纯)、HCl(分析纯)重庆川东化工有限公司;甲醛溶液(分析纯)、NaOH(分析纯)、NaCl(分析纯)，成都科龙化工试剂厂;水为超纯水。

1.2 仪器与设备

LC－10A高效液相色谱仪(含紫外检测器)，日本岛津公司;Milli－Q超纯水器，美国Millipore公司;可调式氮吹仪，北京中诺远东公司;微型漩涡混合仪，沪西分析仪器厂;台式高速离心机，德国Eppendorf公司;FS－2可调高速匀浆机，江苏金坛科析仪器有限公司;DK－8D三孔电热恒温水槽，上海齐欣科学仪器有限公司;电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;磁力加热搅拌器，常州澳华仪器有限公司;PH计，赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 生物胺的HPLC测定方法

1.3.1 样品的衍生

2 mL的生物胺标准混合溶液，加入1 mL 2 mol/L NaOH，10 μL 苯甲酰氯，然后旋涡振荡30 s，在黑暗中置于30℃水浴条件下避光反应40 min，期间每隔10 min振荡1次。反应完后用2 mL饱和NaCl溶液中断反应。然后用3 mL乙醚萃取，1 200 r/min离心10 min，用移液枪移取乙醚层，再重复1次，将乙醚层移置于规格为10 mL的离心管中，35℃下氮气吹干，然后用1 mL甲醇(色谱级)溶解，微滤(0.45 μm)后用于测定生物胺含量［8］。

1.3.2 标准生物胺溶液的配制

准确称取腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、2-苯乙胺、组胺、酪胺各50 mg，用0.1 mol/L的HCl定容至50 mL，制成标准储备液备用。

分别取以上标准储备液，用0.1 mol/L HCl配制成终浓度分别为 1.0、2.0、5.0、10、20、40、80 μg/mL的混合标准溶液。然后按1.3.1方法进行衍生处理和分析，并绘制标准曲线。

1.3.3 样品预处理

称取10.0 g用研钵研磨均匀的豆豉样品，置于100 mL离心管中，加20 mL 0.4 mol/L HClO4溶液分散，用匀浆机匀浆1 min，振荡提取5 min，静置5 min，然后在6 800 r/min离心30 min;将上清液移入50 mL容量瓶中，用20 mL HClO4溶液重复提取1次，上清液合并，用0.4 mol/L HClO4溶液定容至50 mL，取2 mL该溶液按1.3.1中的方法衍生处理。

1.3.4 液相色谱分析条件［9］

色谱柱:Agilent XDB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相A为超纯水，流动相B为甲醇;梯度洗脱(洗脱条件:0～5 min，40%A;5～10 min，40%A→35%A;10～15 min，35%A→30%A;15～20 min，30%A→25%A;20～25 min，25%A→15%A;25～30 min，15%A→5%A;30 ～35 min，5%A→0%A;35 ～36 min，0%A→40%A;36 ～45 min，40%A);流速为1.0 mL/min;紫外检测波长为254 nm;进样量20 μL;柱温 30℃。

1.4 理化指标测定方法

水分含量测定:采用常规的烘箱干燥法，见GB/T 5009.3 －2003［10］;总酸含量测定:采用酸碱滴定的酸度计法［11］;氨基态氮含量测定:采用甲醛滴定法，见 SB/T 10170 －2007［11］。

2 结果与分析

2.1 生物胺标准品的HPLC图

通过单个生物胺标准样品的HPLC检测，得到8种生物胺的保留时间。其中，腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亚精胺、精胺、组胺、酪胺的保留时间分别为7.068 min、8.144 min、9.826 min、11.490 min、12.778 min、18.346 min、20.359 min和23.980 min。混合生物胺的HPLC检测结果可以得出该方法对8种生物胺的分离效果较好(见图1)。8种生物胺标准曲线的回归方程见表1，R2均在0.993 1～0.999 7，说明8种生物胺的峰面积与其相应浓度呈现良好的线性相关性。

图1 生物胺标准品的液相色谱图Fig.1 Chromatogram of biogenic amines standards

表1 生物胺标准曲线的回归方程及R2Table 1 Regression equation and R2of biogenic amines standard curve

2.2 制曲过程中豆豉水分含量的变化

由图2可知，永川豆豉制曲过程中水分含量呈明显下降的趋势。制曲过程0天时水分含量最高，为46.97%，到制曲过程第11天时水分含量最低，已降至33.75%，这是由于制曲过程中水分蒸发、微生物利用等原因造成的。

图2 永川豆豉制曲过程中水分含量的变化Fig.2 Water content change during Yongchuan douchi koji processing

2.3 制曲过程中豆豉总酸含量的变化

总酸含量直接影响永川豆豉制曲过程中各种酶的活性，也间接影响微生物的生长代谢，从而对豉曲质量的好坏也产生很大的影响。由图3可知，永川豆豉制曲过程中总酸的含量呈先上升后下降的趋势，大豆蒸煮结束时的总酸含量为1.53 g/100 g，到制曲过程第8天时总酸含量达到最高，为5.05 g/100 g，而到第11天时已降至4.27 g/100 g。这是由于制曲前期部分细菌得到一定程度生长导致酸性代谢物质增多，从而使总酸含量增大，但随着蒸发，水分含量下降、毛霉大量繁殖使豆豉总酸含量下降。

图3 永川豆豉制曲过程中总酸值的变化Fig.3 Total acid value change during Yongchuan Douchi koji processing

2.4 制曲过程中豆豉氨基态氮含量的变化

在豆豉成熟过程中，氨基酸态氮含量高低是判断豆豉是否成熟的重要指标。如图4所示，永川豆豉在制曲过程中氨基酸态氮含量呈先增加后下降的趋势。到第8天时氨基酸态氮含量达到最高，为0.55 g/100 g，随后氨基酸态氮含量有所降低。

图4 永川豆豉制曲过程中氨基态氮含量的变化Fig.4 Amino nitrogen content change during Yongchuan Douchi koji processing

2.5 永川豆豉制曲过程中单种生物胺含量的变化

永川豆豉在制曲过程中生物胺含量变化见表2。在永川豆豉制曲过程中共检测出7种生物胺，分别是腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亚精胺、组胺、酪胺，而精胺在整个制曲过程中都没有检出。在各个制曲阶段，腐胺的含量都是最高的，其次是尸胺和组胺。永川豆豉制曲过程中各种生物胺含量都在不断变化，色胺、2-苯乙胺由最初的未检出分别增加到53.59 mg/kg、52.02 mg/kg;组胺也由制曲初期的18.49 mg/kg减少到几乎为0;酪胺也由最初的未检出缓慢增长到20.57 mg/kg，随后含量降到几乎为0;腐胺含量变化呈缓慢的增长;各种生物胺含量均在60 mg/kg以下。美国食品药品监督局规定了水产品中组胺含量为不得超过 50 mg/kg［12］。Nout等［13］认为发酵食品中 2-苯乙胺含量在30 mg/kg以上就可对人体构成潜在的危险。可见永川豆豉在制曲过程中组胺含量一直低于对人体产生危害的上述含量值50 mg/kg，但制曲后期2－苯乙胺含量高于上述含量值30 mg/kg。

表2 制曲过程中永川豆豉生物胺的浓度(mg/kg)Table 2 Contents of biogenic amines during Yongchuan Douchi koji processing

2.6 制曲过程中豆豉生物胺总量的变化

对不同制曲时间的永川豆豉进行检测，能检出7种生物胺，只有精胺未能检出。如图5所示，制曲过程中生物胺总量初期上升后期下降，变化范围在108.64～234.37 mg/kg。制曲0天时生物胺总量最低为108.64 mg/kg，制曲第8天生物胺总量上升到最高值，为234.37 mg/kg，随后生物胺总量开始下降。Santos［14］认为食品中生物胺总量超过1 000 mg/kg会对人体健康产生极大威胁。可见制曲过程中豆豉生物胺总量一直低于对人体产生危害的上述含量值1 000 mg/kg。生物胺总量的变化趋势基本与氨基酸态氮基本一致，这与其他相关报道的结果一致［15－16］。

图5 永川豆豉制曲过程中生物胺总量的变化Fig.5 Total biogenic amine content change during Yongchuan Douchi koji processing

3 结论

永川豆豉在制曲过程中，水分含量呈下降趋势，由最初的46.85%降到33.75%;总酸和氨基态氮的含量均呈先增加后下降的趋势。制曲过程中共检测出7种生物胺，分别是腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亚精胺、组胺、酪胺，而精胺在整个制曲过程中都没有检出。制曲过程中豆豉中主要以腐胺、色胺和2-苯乙胺为主，含量分别达到59.67、53.59、52.02 mg/kg，三者共占生物胺总量的78.81%，所有生物胺含量均在60 mg/kg以下。为了深入了解永川豆豉制曲过程中生物胺的变化的原因，生物胺产生机理还需进一步研究。

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