中草药提取物体外抗乙型肝炎病毒活性的筛选

张玉强 郑超 杨赟 刘敏 徐麟 符小发

[摘要] 目的 从31种中草药醇提物中筛选出具有抗HBV活性的药物。 方法 60%乙醇回流提取药物醇提物；用四甲基偶氮唑盐比色法检测药物对细胞的毒性；采用酶联免疫法检测细胞培养上清液的HBsAg和HBeAg；用治疗指数判断药物的抗HBV作用。 结果 实验发现，槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草等5种中草药具有一定的抗HBV活性，半数有毒浓度分别为83.2、926.5、509.9、477.7和577.7 μg/mL；最大无毒浓度时，5种药物对HBeAg的抑制率分别为52.9%、63.7%、78.1%、56.8%和66.3%，对HBeAg的半数抑制浓度为29.7、34.4、42.1、91.4和27.8 μg/mL，治疗指数分别为2.8、26.9、12.1、5.2、20.8。 结论 槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺和溪黄草抗HBV效果较好，有进一步研究的价值。

[关键词] 中药提取物；乙型肝炎病毒；HepG2 2.2.15细胞；HBsAg；HBeAg

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）05-37-05

乙肝病毒（HBV）属嗜肝DNA病毒，感染HBV后不仅会引起急、慢性肝炎，而且还可能导致原发性肝癌[1-2]。在我国，至少有一半以上的人感染过乙肝病毒，严重的危害着人民的健康[3]。干扰素与核苷类似物是目前国内外公认的抗乙肝药物，已大量用于治疗慢性乙肝。但干扰素副作用较大，而核苷类易引起病毒变异，导致治疗效果下降[4-5]，因此，研究抗HBV药物已成为治疗乙型肝炎的重中之重。

我国中草药资源丰富，实践表明许多天然药物不仅具有明确的治疗乙型肝炎的作用，而且毒性低，副反应小，从中分离提取活性成分已成为当前新型抗乙肝药物研发的热点之一。但由于HBV宿主仅限于人和类人猿，不适于动物模型的建立[6]。为此，Camille等[7]于1986年将HBV基因组转染至人肝癌细胞株HepG2，经G-418筛选得到细胞克隆，建

立了HepG2 2.2.15细胞株，已被国内外作为抗乙肝药物筛选的细胞模型，大量应用于药物的筛选研究[8-12]，且已经成为申报肝炎新药必具的抗病毒实验模型[13]。

为此，通过查阅相关书籍[14-15]，选取具有治疗肝炎、清热解毒、保肝护肝等功效的中草药共31种，以HepG2 2.2.15细胞为评价模型，运用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法及酶联免疫（ELISA）法，检测各中草药提取物的细胞毒性及对抗原分泌的抑制率，初步筛选出具有抗HBV活性的药物。

1 材料

1.1 中草药

实验用中草药购自河北安国聚福中药材有限公司，药材名称见表1。

1.2 HepG2 2.2.15细胞株

HepG2 2.2.15细胞购自美国MountSinai医学中心，可稳定、持续的分泌HBsAg、HBeAg，本实验室自行传代培养。

1.3 主要试剂

DMEM培养液，青霉素-链霉素，胰蛋白酶，胎牛血清（美国GIBCO公司）；G-418、DMSO（Amresco公司）；MTT（美国Sigma公司）；HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂盒（北京科卫临床诊断试剂有限公司）。

1.4 器材

培养瓶，96孔板（美国Corning）；二氧化碳培养箱（日本SANYO）；酶标仪（美国BIO-RAD）；倒置显微镜（重庆光电仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

2 方法

2.1 中药醇提物样品的制备

取粉碎后药材，加入60%乙醇，料液比1︰10，回流提取3次，每次2 h，提取液经过滤除渣、旋转蒸发仪60℃减压浓缩后，经干燥、研磨得醇提物干粉，4℃保存备用。

2.2 HepG2 2.2.15细胞培养

细胞培养参考Tianzhen Wang[16]的方法，具体步骤如下：细胞长满瓶壁后，弃培养液，用pH7.2 PBS洗2遍，加入适量的0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化，待细胞形态变化并且开始脱落时，弃消化液，加培养液轻轻吹打均匀，1∶4传代，用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、380 μg/mL G-418的培养液继续培养（本实验所用培养液均加380 μg/mL G-418）。

2.3 药物对HepG2 2.2.15细胞毒性试验

MTT比色法[13，17]检测药物对细胞的毒性。按上述方法将细胞消化吹匀后，调整细胞浓度至3×104个/mL，接种于96孔板中，每孔150 μL。37℃、5%CO2条件下培养24 h后，加入含有1200，600，300，150，75，37.5，18.8，9.4 μg/mL等不同浓度药物的培养液，每孔150 μL，各浓度分别设3个复孔，同时设对照组及无细胞的空白组。培养72 h后，弃上清，每孔加入10 μL 5 mg/mL的MTT及100 μL培养液，继续培养4 h；弃上清后每孔加入150 μL DMSO，震荡至甲瓒蓝完全溶解，用酶标仪检测570 nm波长下各孔OD值，通过计算细胞存活率来判断药物对细胞毒性的大小。半数有毒浓度TC50用Reed-Meuench法计算[18]。

式中：B=log<50%药物浓度，A=log>50%药物浓度，C=A-B，下同。

2.4 药物对HBeAg分泌的抑制试验

参考王选举等[19]报道的方法，略有改动。将细胞消化后，调整细胞密度为3×104个/mL，接种至96孔板种，每孔150 μL。37℃、5% CO2条件下培养24 h后，加入无毒浓度以下2倍稀释的药物，每种药物设定6个梯度，每梯度3个复孔，同时设定3孔不加药物的对照组，4 d后换相同浓度的药物继续培养，药物作用8 d后收集上清液，-20℃保存。用ELISA检测试剂盒检测上清中HBsAg及HBeAg，酶標仪测定450 nm时各孔OD值，结果以抗原抑制率表示：

2.5 藥物效果评价

药物的安全性及临床应用前景通常以治疗指数（TI）来评价。TI=TC50/IC50，当TI>2.0时为有效低毒，1.02.0时药物才有进一步研究的价值。

3 结果与讨论

3.1 31种中草药抗乙肝活性的筛选

结合MTT法及ELISA法检测药物抗乙肝活性的结果见表1。最大无毒浓度时部分中草药表现出一定的抗乙肝活性，其中槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草5种中草药在最大无毒浓度时具有较好的抑制HBeAg活性，抑制率分别为52.9%、63.7%、78.1%、56.8%、66.3%。紫草、木蝴蝶、狼杷草、怪柳、一枝蒿、阿魏、金不换等中草药对HBeAg抑制率为30%～50%，有轻度抑制作用，其它药物对HBeAg抑制率<30%。所有药物对HBsAg的抑制率均<50%，其中葡萄根和槟榔对HBsAg抑制率为38%和30.9%，有轻度抑制作用，其它药物对HBsAg抑制率均<30%。为此，本实验选取槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草等5种效果较好药物继续检测。

3.2 5种效果较好中草药对HepG2 2.2.15细胞的毒性

采用2.3方法，检测槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草5种药物在不同浓度时对2.2.15细胞的毒性并计算TC50值。结果表明，槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草的TC50分别为83.2、926.5、509.9、477.7、577.7 μg/mL，其中佛甲草TC50最大，对细胞毒性最小，其余依次为溪黄草、石榴皮、骆驼刺和槟榔。见表2。

3.3 5种效果较好中草药对HepG2 2.2.15细胞抗原分泌的抑制作用

采用2.4方法检测5种药物对HepG2 2.2.15细胞抗原分泌的抑制作用，结果见表3。由表可知，槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草等药物对HBeAg分泌的抑制作用呈明显剂量依赖关系，IC50依次为29.7、34.4、42.1、91.4、27.8 μg/mL；但5种中草药对HBsAg的抑制作用均较弱，槟榔、佛甲草、石榴皮对HBsAg的最大抑制率分别为30.9%、28.0%和23.2%，而骆驼刺和溪黄草对HBsAg的分泌无抑制作用。

3.4 5种效果较好中草药抗HBV效果评价

槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草等5种中草药对HBeAg的治疗指数分别为2.8、26.9、12.1、5.2、20.8，全部>2，均为有效低毒。其中，佛甲草的TI值最高，效果最好，其它依次为溪黄草、石榴皮、骆驼刺和槟榔；由于5种中草药对HBsAg抑制率<50%，无法计算IC50值，故无法计算治疗指数。见表4。

4 结论

本实验对31种中草药醇提物的抗HBV活性进行了初步筛选研究，结果显示，槟榔、佛甲草、石榴皮、骆驼刺、溪黄草5种中草药对HBeAg具有较好的抑制作用，而HBeAg是HBV大量复制时产生的一种可溶性蛋白，代表着HBV复制的强弱，与病毒传染性正相关[23-25]，为此，推测这5种中草药很可能具有抗乙肝的作用，尤其对降低或控制乙肝患者的传染性方面起到一定效果，可进一步追踪分离活性部位或组分。

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（收稿日期：2013-01-15）