兔急性房颤时心房肌钙通道α1C、β1及钾通道Ikr的表达和药物干预

邓贵智 胡建新

[摘要] 目的 通过建立兔急性房颤的模型观察伊布利特、参松养心胶囊及两药联合用药对兔心房肌L型钙离子通道α1C、β1和钾离子通道Ikr表达的影响。 方法 通过建立兔急性房颤模型，应用RT-PCR、Western blot检测正常组、刺激组、伊布利特组、参松养心胶囊组和联合用药组心房肌α1C、β1 、IKr基因和蛋白表达水平，并进行统计学分析。结果 （1）与正常组比较，刺激组L型钙离子通道α1C基因与蛋白表达及β1基因表达显著降低（P<0.01）；而Ikr基因及蛋白表达无明显变化（P>0.05 ）。（2）与刺激组比较，伊布利特组α1C基因与蛋白表达及β1基因表达高于刺激组（P <0.01），Ikr基因及蛋白表达低于刺激组（P<0.01）；参松养心胶囊组α1C基因与蛋白表达及β1基因表达水平与刺激组无明显差异（P>0.05），Ikr基因及蛋白表达水平无明显差异（P>0.05）；联合用药组α1C基因与蛋白表达及β1基因表达高于刺激组（P <0.01），IKr 基因及蛋白表达低于刺激组（P <0.01）。（3）与伊布利特组比较，伊布利特与参松养心胶囊联合用药组α1C基因与蛋白表达及β1基因表达水平无显著差异（P >0.05）；Ikr基因及蛋白表达水平无显著差异（P >0.05）；参松养心胶囊组α1C基因与蛋白表达及β1基因表达水平低于伊布利特组（P <0.01），Ikr基因及蛋白表达水平高于伊布利特组（P <0.01）。（4）参松养心胶囊组α1C基因与蛋白表达及β1基因表达水平低于联合用药组（P <0.01），Ikr基因及蛋白表达水平高于联合用药组（P <0.01）。 结论 （1）房颤诱发术后刺激组兔心房肌L型钙离子通道α1C、β1 表达明显下降，而IKr表达无明显变化。（2）伊布利特可抑制L型钙离子通道α1C、β1 表达下降及降低钾离子通道IKr表达。参松养心胶囊对不能抑制L型钙离子通道α1C、β1表达下降，对钾离子通道Ikr的表达无明显影响。（3）联合用药对比单用伊布利特对α1C、β1、IKr的表达无明显影响。

[关键词] 急性房颤；L型钙离子通道；钾离子通道

[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）05-30-05

心房颤动（AF），简称房颤，是最常见的心律失常之一，全球约有3%～5%人群发生房颤。房颤的机制目前尚不明确，房颤发生时，心房肌细胞离子通道会发生一系列的改变，从而产生电重构，主要表现为动作电位时程（APD）、心房有效不应期（AERP）的缩短，不应期离散度增大、不应期频率适应性下降以及传导速度减慢。Bosch等[1]研究表明，房颤发生时，心肌内有多种离子流的改变，特别是L型钙离子流及钾离子流的改变，两者可能是导致心肌电重构的主要原因。本实验研究拟探讨伊布利特、参松养心胶囊及伊布利特与参松养心胶囊联合应用对房颤的预防作用，及其对房颤诱发实验中兔心肌α1C、β1、IKr表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

60只日本大耳兔随机分正常组、刺激组[生理盐水5 mL/（kg·d）灌胃]、伊布利特组[伊布利特（安徽丰原药业股份有限公司，H20061029）0.1 mg/（kg·d）耳缘静脉推注]、参松养心胶囊组[参松养心胶囊（石家庄以岭药业股份有限公司，Z20103032]0.2 g/（kg·d）灌胃]、伊布利特与参松养心胶囊联合应用组，简称联合用药组[耳缘静脉推注伊布利特0.1 mg/（kg·d）及参松养心胶囊0.2 g/（kg·d）灌胃]。均在诱发房颤实验前用药4周。除正常组外，其余各组均于用药后4周进行房颤诱发试验。

1.2 方法与步骤

1.2.1 房颤诱发 3%戊巴比妥1 mL/kg经兔耳缘静脉麻醉，颈部及左胸前区予NaS2脱毛备皮，行颈部气管切开，气管插管，动物呼吸机辅助呼吸（呼吸频率34～60次/min，潮气量25～30 mL，吸/呼比3/1），同步记录体表心电图。胸骨正中开胸，逐层切开胸壁组织，分离出第3、4根肋骨，小心离断（注意勿伤及肋间动脉），剪开胸膜，暴露心脏，剪开并悬吊心包，充分暴露左心房，予自制电极一根固定于左心耳（电极头端处可导电，其余处均不能导电），另一根电极固定于胸大肌。连接心电生理刺激仪，进行程序期前刺激与Burst刺激相结合的方法诱发房颤，观察心电图，出现“丁”字形起搏信号表示刺激有效。多功能心电刺激仪设定：脉宽2 mv，输出电压为2倍舒张期阈值，S1/S2为8/1，步长-10 ms。S1S2固定于心房有效不应期，引入第二个早搏刺激S3时加30 ms，S2S3从基础周长的80%开始，以10 ms步长反扫至S3落入不应期。以同样的方法引入第三个早搏刺激S4直至诱发出房颤。上述方案不能诱发，则以周长为100 ms的Brust刺激进行诱发。如均不能诱发，则房颤诱发不成功。刺激组、伊布利特组、参松养心胶囊组、联合用药组房颤诱发条件相同。

1.2.2 标本采集 每组家兔于刺激结束后在麻醉状态下取下心脏，用生理盐水冲洗干净，取少许左心耳组织放入液氮冷冻保存，以备提取组织RNA及蛋白。

1.2.3 RNA的提取与R-t PCR 取80 mg左心耳组织剪碎匀浆，采用Catrimox-Guanidinium一步法提取总RNA，提取物以40μL DEPC水溶解，采用紫外分光度仪测定溶度备用。逆转录-聚合酶链式反应：RNA变性，逆转录合成cDNA，以GAPDH为内参照，在同一反应体系中行PCR。L型钙通道α1C亚基正义链：5-CTGGACAAGAACCAGCGACAGTGCG-3 ，反义链：50-ATCACGATCAGGAGGGCCACATAGGG-3。β1亞基正义链：5-AGCTTGCGCTGAGTTCTTGC-3，反义链：5-TCCCTTGCTTTGCTCTCTG-3。IKr正义链：5-TCGCACCATTAGCAAGATTC-3，反义链：5-GGATGAGCCAGTCCCACA-3。GAPDH正义链：5-GCTTTTAACTCTGGCAAAGTG-3，反义链：5-GATGATGACCCTTTTGGCTC-3。曲4μL PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，120 V，100 mA，30 min，溴化乙锭染色，凝胶成像仪成像，用SnyGene凝胶成像分析系统，根据条带灰度和宽度自动分析。

1.2.4 蛋白质的提取与Western blot 取100 mg组织放入研钵剪碎研磨（在冰上进行），加入蛋白提取液300μL、10%蛋白抑制剂30μL继续研磨，吸取提取液冰浴放置30 min，4℃ 12 000 rpm离心10 min，吸取上清，按Bradford比色法测定蛋白浓度，加loading buffer煮沸5～10 min。聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离蛋白质，半干式电转膜90 min，5%脱脂牛奶的TBST封闭液，室温1 h，分别加α1C、Ikr单克隆抗体4℃封闭过夜，加入含有1∶2000稀释辣根酶标记的相应二抗工作液，室温下孵育1 h，X光片曝光显影，用Sicon Image软件对Western blot条带进行灰度分析，按：蛋白相对含量=该蛋白条带的灰度值/上样对照条带的灰度值公式计算蛋白相对含量。

1.3 统计学处理

用SPSS17.0统计软件进行分析，所有计量资料以（）表示，检验2个或2个以上样本率用x2检验，多组间均数比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 刺激组、伊布利特组、参松养心胶囊组、联合用药组房颤诱发情况

联合用药组、伊布利特组两组房颤诱发率明显低于刺激组（分别为x2=5.48，P=0.01；x2=4.84，P=0.02），伊布利特组与联合用药组比较无统计学差异（x2=2.12，P=0.34）。参松养心胶囊组与刺激组比较，差异无统计学意义（x2=0.68，

2.2 α1C、β1、IKr基因表达水平

联合用药组、伊布利特组、参松养心胶囊组、刺激组L型钙离子通道α1C、β1基因表达水平均低于正常组（t=6.47，P<0.01）。伊布利特组α1C、β1基因表达水平高于刺激组（t=5.86，P<0.01），伊布利特组α1C、β1基因表达水平高于参松养心胶囊组（t=8.26，P<0.01）；伊布利特组与联合用药组比较α1C、β1基因表达水平无明显差异（t=1.37，P>0.05）。参松养心胶囊组α1C、β1基因表达水平与刺激组比较无明显差异（t=1.61，P>0.05）。联合用药组α1C、β1基因表达水平高于参松养心胶囊组（t=3.68，P<0.05）。见表2。α1C、β1、IKr基因表达见图3、4、6。

2.3 α1C、IKr蛋白表达水平

联合用药组、伊布利特组、参松养心胶囊组、刺激组L型钙离子通道α1C、蛋白表达水平均低于正常组（t=3.18，P<0.05），伊布利特组α1C蛋白表达水平高于刺激组（t=6.21，P<0.01），伊布利特组α1C蛋白表达水平高于参松养心胶囊组（t=7.56，P<0.01）；伊布利特组与联合用药组比较α1C蛋白表达水平无明显差异（t=2.01，P>0.05）。参松养心胶囊组α1C蛋白表达水平与刺激组比较无明显差异（t=3.67，P>0.05）。联合用药组α1C、β1基因表达水平高于参松养心胶囊组（t=3.68，P<0.05）。见表3。α1C、IKr蛋白表达见图5、6。

3 讨论

3.1 经房颤诱发实验后L型钙离子通道α1C、β1的表达

众多研究表明房颤可引起L型钙离子通道α1C基因及蛋白表达下降，Ca2+内流减少，动作电位及有效不应期缩短[2-3]，Bosch等[1]研究亦发现房颤患者中β1亚基比窦性心律者表达降低，并指出在房颤患者及动物模型中，L型钙离子流密度明显下降，α1C，β1亚基及蛋白表达水平较窦性心律者降低。本研究结果表明，在兔急性房颤诱发实验中，经对兔心房刺激后，刺激组L型钙离子通道α1C、β1基因及蛋白表達水平明显低于正常组（P<0.01），提示心房经过快速起搏时，L型钙离子通道活性降低。心肌细胞保持细胞内Ca2+离子平衡主要通过电压依赖方式和钙依赖方式使钙离子通道失活（CDI）[4]，当心房经过快速起搏时，进入细胞内Ca2增多，并诱发肌浆网释放更多Ca2+，使细胞Ca2+内异常升高，触发CDI，使LVDCC活性降低，L型钙离子通道电流密度下降，这是α1C、β1基因及蛋白表达下降的可能机制。LVDCC活性降低，Ca2+内流减少，平台期Ca2+降低，动作电位时程及心房有效不应期进行性缩短，心房传导离散度增加，不应期频率适应性降低[5-6]，从而有利于房颤的发生和维持。因此，在房颤的形成过程中，α1C、β1亚基表达下降，L型钙离子通道活性降低，动作电位时程、心房有效不应期缩短等都起着重要的作用。推测通过药物干预使L型钙离子通道活性升高，平台期Ca2+增多，适当延长动作电位时程及心房有效不应期，可以预防及减少房颤的发生，降低房颤的发生率。

3.2 经房颤诱发实验后Ikr的表达

房颤时，动作电位时程及心房有效不应期进行性缩短，复极加速是其重要原因。在心肌的复极过程中，有多种离子流的参与，其中延迟整流钾通道（IK）在心肌的复极过程中起着关键作用。心肌细胞上的延迟整流钾离子通道包括三种钾电流：快激活延迟整流钾电流（IKr）和慢激活延迟整流钾电流（IKs），以及超快激活延迟整流钾电流（IKu），其中以延迟整流钾电流（IKr）最为重要[7]。IKr编码基因是HERG，其变异可致遗传性长QT综合征[8-9]，EHRG表达增高，可使快激活延迟整流钾电流增加，复极时间减少，动作电位时程及心房有效不应期缩短。Manios等[10]研究也表明IKr通道基因表达升高，可以使心肌细胞动作电位2、3相外向钾离子流增加，使心肌复极加快，动作电位时程及有效不应期缩短。但Yue等[11]在对犬房颤诱发实验中发现，在经快速起搏的犬心房及已成功诱发房颤的犬心房中，IKr表达与对照组比较并无差异。

本实验结果表明，在经快速起搏的兔心房中，刺激组Ikr通道基因及蛋白表达水平与正常组比较无明显差异，与Yue等实验结果一致。因此，本研究认为在房颤的发生过程中，心房快心率时IKr通道基因及蛋白不会升高，IKr可能没有参与心房的电重构，房颤发生时，APD及ERP缩短可能由L型钙通道及其他离子通道功能失调所致。IKr通道基因表达异常升高，可以使细胞动作电位2、3相外向钾离子流增加，复极加快，动作电位时程及有效不应期缩短，可能有利于房颤的发生及维持，Li等[12]研究发现犬左房HERG蛋白表达高于右房，同时观察到犬左房动作电位时程及心房有效不应期短于右房，考虑左心房IKr通道基因高表达是左心房好发房颤的因素之一，但在房颤发生的过程中，IKr基因及蛋白表达并无明显变化。因此，可以推测应用药物干预使心房IKr通道基因表达适当下降，可以减少房颤的发生。Lai等[13]发现，在慢性房颤患者中，IKr通道基因表达水平低于窦性心律者，其表达水平降低可能是对长期房颤时缩短的动作电位时程及心房有效不应期的一个自身的反馈调节，从而减轻房颤后心房的电重构，是一种保护机制。

3.3 經房颤诱发实验后伊布利特、参松养心胶囊干预的效果

本实验表明伊布利特可以抑制兔心房快速起搏时L型钙离子通道α1C、β1表达的下降。α1C、β1是LVDCC主要功能亚基，α1C、β1表达的降低，可使L型钙通道活性降低，L型钙电流（ICa-L）密度下降，Ca2+内流减少，心肌细胞动作2相平台期缩短，APD及ERP缩短，ERP频率适应性降低，有利于折返的形成，使房颤得以发生及维持。伊布利特能够抑制α1C、β1表达下降，促进Ca2+内流，有效延长APD及ERP，从而不利于心律失常的发生，可能是其具有预防兔急性房颤发生作用的机制之一。本研究实验表明，伊布利特可以降低钾离子通道IKr基因及蛋白的表达。IKr是细胞复极的主要离子流，与Na+和Ca2+内流的相对速率决定平台期的长短。IKr通道基因的高表达，可以使心肌细胞复极时外向钾离子流增加，使复极加快，APD及ERP缩短。伊布利特可以降低IKr通道基因的表达，使复极时外向钾离子流减少，可以使复极时间延长APD及ERP，从而不利于房颤的发生及维持。因此，心脏瓣膜术后等房颤高发人群中，应用伊布利特可能能起到很好的预防作用。伊布利特其副作用可过度延长有效不应期及QT间期，部分患者可致尖端扭转型室速（Tpd）[14-15]，有报道伊布利特致Tpd发生率为4.3%，可能与其使钙离子内流增多，过度阻滞IKr，易诱发早期后除极有关。

该实验发现参松养心胶囊组兔急性房颤诱发率41.7%明显低于刺激组75.0%，但可能由于样本数量偏少，差异无统计学意义，其对房颤的发生可能有一定的影响，有待于进一步的研究。本研究发现参松养心胶囊组α1C、β1的表达与刺激无明显差异（P>0.05），但低于正常组（P<0.01）。提示参松养心胶囊不能抑制心房快速起搏时α1C、β1表达的下降，也不能使心房快速起搏时已表达下降的α1C、β1表达进一步下降。因为在心房快速起搏时，L型钙离子通道活性下降，α1C、β1的表达已有降低，所以尚不能提示其对钙离子通道是否有阻滞作用。伊布利特与参松养心胶囊联合用药组与伊布利特组无明显差异（P>0.05），提示参松养心胶囊不能协同伊布利特抑制α1C、β1表达的下降，也不能使伊布利特抑制α1C、β1表达的下降作用降低。李宁等[16]研究发现参松养心胶囊提取干粉对正常心肌细胞INa、ICa-L有阻滞作用，因此可以推测，参松养心胶囊对正常的L型钙离子通道可能具有阻滞作用，但对房颤发生时活性已降低的L型钙离子通道影响有限。

本实验表明参松养心胶囊组IKr表达与正常组、刺激组无明差异（P>0.05），提示参松养心胶囊对兔心房肌IKr表达没有影响。联合用药组IKr表达与伊布利特组无明显差异，提示参松养心胶囊不能影响伊布利特对IKr的阻滞作用。

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（收稿日期：2013-01-31）