乙酰丁香酮及共培养pH对黄瓜遗传转化效率的影响

宁宇　李蕾　苗永美　李季　陈劲枫

摘 要： 以黄瓜品种长春密刺子叶节为外植体，研究了乙酰丁香酮（AS）的添加方式、浓度及共培养pH对黄瓜遗传转化的影响。结果表明：在侵染菌液和共培养基中加入AS均可显著提高黄瓜抗性芽诱导率，浓度以100 μmol·L-1为最佳。共培养基的pH 对黄瓜抗性芽诱导率也有影响，其中在pH 5.2的共培养基上黄瓜转化率最高。研究结果优化了黄瓜遗传转化体系，提高了黄瓜转化效率，为推动黄瓜转基因工作奠定了坚实的基础。

关键词： 黄瓜； 遗传转化； 乙酰丁香酮； pH

黄瓜（Cucumis sativus L.）是一种重要的经济作物，在全世界范围内有较大的种植面积。黄瓜遗传基础狭窄，种质资源较少，很多重要的遗传性状无法通过有性杂交的手段来改良。因此，基因工程技术就成为对常规育种的有效补充手段。农杆菌介导的子叶节法是黄瓜转基因中最为常用的方法[1]，目前已通过这种方法将iaaM[2]、BnCS[3]及opd[4]等基因转入到黄瓜当中。但目前这种方法应用的最大瓶颈是黄瓜的再生困难、转化效率低，因此如何提高黄瓜的转化率，建立稳定、高效的转化体系是黄瓜遗传转化过程中急需解决的问题。

乙酰丁香酮（AS）是宿主细胞分泌出的一种酚类化合物，它可以通过增强农杆菌的侵染效果来提高基因的转化效率。目前在水稻[5]、辣椒[6]及杨树[7]等多种作物的基因转化过程中都会添加一定浓度的AS来提高转化效率。AS的作用效果受多种因素的影响，如植物种类、AS的添加方式和浓度、菌株和载体类型、共培养pH及对AS产生协同作用的物质等[8]。其中AS的添加方式和浓度及共培养pH是较为重要的3个因素，探讨这三者对黄瓜转化率的影响对于优化黄瓜遗传转化体系具有十分重要的意义，而目前这方面的研究还未见报道。

本文以黄瓜品种长春密刺为试材，就AS的添加方式、浓度及共培养pH对黄瓜遗传转化效率的影响进行了探讨，以明确AS在黄瓜遗传转化过程中的使用条件和方法及最佳共培养pH，建立稳定、高效的黄瓜遗传转化体系，为提高黄瓜转化效率、推动黄瓜转基因工作的前进奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 南京農业大学葫芦科作物遗传与种质创新实验室保存的华北型黄瓜长春密刺的高代自交系。

1.1.2 菌株和质粒 所用农杆菌菌株为EHA105（Rif R，Kan R），由本实验室保存和提供。植物表达载体pCAMBIA1304-CsCBF3由本实验室构建，载体上携带标记基因HYG（潮霉素）、目的基因CsCBF3[9]、GUS基因、GFP基因，CaMV35S启动子及NOS终止子，图谱如图1所示。

图1 植物表达载体pCAMBIA1304-CsCBF3的

T-DNA区图谱

1.2 方法

1.2.1 农杆菌-子叶节法转化黄瓜 试验于2012年3月在南京农业大学进行。选取饱满的长春密刺种子，在0.1% 的升汞溶液中消毒灭菌8 min，无菌水冲洗4～6次后用滤纸吸干表面水分，然后接种在MS培养基上。（25±2）℃ 条件下暗培养2 d后转至光下继续培养，4～5 d后切取子叶节，接种在预培养基上黑暗中预培养2 d。

挑取携带表达载体pCAMBIA1304-CsCBF3的农杆菌EHA105单菌落，接种于YEB+50 mg·L-1 Kan+50 mg·L-1 Rif液体培养基中，28 ℃条件下震荡培养16 h。离心后弃去上清液，加入MS0液体培养基重悬至OD600为0.6作为侵染液。将经过预培养的黄瓜子叶节置于MS0农杆菌菌液中侵染10 min，吸干菌液后接种在共培养基上，暗培养3 d后转接至选择培养基上，每2周继代培养1次。

1.2.2 乙酰丁香酮处理 1）侵染菌液中加入乙酰丁香酮：在MS0农杆菌菌液中加入乙酰丁香酮，使终浓度分别为0、50、100、150、200 μmol·L-1，低速震荡培养1 h以活化农杆菌，然后将其作为侵染菌液用于侵染，每处理3次重复。2）共培养基中加入乙酰丁香酮：试验采取两因素正交设计，将共培养基pH分别设为4.9、5.2、5.5、5.8，在每个pH水平上分别添加乙酰丁香酮至终浓度分别为0、50、100、150、200 μmol·L-1，以未添加AS的MS0农杆菌菌液为侵染液，每处理3次重复。

1.2.3 数据统计及分析 抗性芽在选择培养基上进行继代培养，继代2～3次（选择培养30 d）后统计长芽外植体数与总外植体数。将抗性芽诱导率（用产生抗性芽的外植体数与总外植体数的比值的百分率表示）作为评价黄瓜转化率的指标。利用SPSS 20.0软件对数据进行均值、标准差计算及显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 侵染菌液中添加AS对黄瓜转化效率的影响

将预培养2 d的黄瓜子叶节浸至于添加了不同浓度乙酰丁香酮的菌液当中侵染，侵染后先在共培养基上暗培养3 d，然后接种在选择培养基上筛选，30 d后统计抗性芽诱导率。结果表明（表1），与对照相比，侵染菌液中添加AS可显著的提高黄瓜抗性芽诱导率。随着其浓度的增加，抗性芽诱导率也随之升高，浓度为100 μmol·L-1时达到最高。若AS浓度继续增加，诱导率反而下降。说明在侵染菌液中加入AS可有效提高黄瓜的转化率，但浓度不宜过高，以100 μmol·L-1为最佳。

表1 菌液中添加乙酰丁香酮对

抗性芽诱导率的影响

[注] 大写字母表示差异极显著（P<0.01），小写字母表示差异显著（P<0.05）。下同。

2.2 共培养基中不同AS浓度与pH组合对黄瓜转化效率的影响

将预培养2 d的黄瓜子叶节浸至于未添加乙酰丁香酮的菌液中侵染，侵染后接种在不同浓度AS和pH组合的培养基上共培养3 d，然后转至选择培养基上进行筛选培养，30 d后统计总外植体数和长芽外植体数，计算抗性芽诱导率（表2）。结果表明，不同浓度的AS和不同共培养基pH的配合使用对黄瓜抗性芽诱导率有显著影响。在不同的组合当中，在不添加AS的pH为4.9或5.8的共培养基上获得的抗性芽诱导率最低，均为13.33%。而在pH为5.2的共培养基上添加100 μmol·L-1的AS时获得的黄瓜抗性芽诱导率最高，达到44%，因此，该组合可作为黄瓜转化过程中最适的共培养条件。

2.3 共培养基中AS浓度对黄瓜转化效率的影响

从表3可以看出，乙酰丁香酮濃度单因素的F值达到了极显著的水平，说明共培养阶段AS浓度对黄瓜抗性芽诱导率有极大的影响，因此本研究将其作为主效应因子就其对黄瓜转化率的影响规律进行了分析。结果表明（表4），与不添加AS的对照相比，共培养基中添加AS可显著提高黄瓜抗性芽诱导率。在本研究所设的AS浓度范围内，随着浓度的增加，黄瓜抗性芽诱导率也不断升高，并且在浓度为100 μmol·L-1时达到最大，为38.05%。但随着AS浓度继续升高，诱导率反而降低，原因可能是AS配制时一般使用二甲基亚砜（DMSO）溶解，而二甲基亚砜有剧毒，浓度过高抑制了农杆菌的生长。

表4 共培养基中乙酰丁香酮浓度对

抗性芽诱导的影响

2.4 共培养pH对黄瓜转化效率的影响

共培养 pH 的高低也会影响农杆菌的侵染效果，为探索黄瓜转化过程中最适的共培养pH，将其作为主效应因子对其进行分析。统计结果显示（表5），不同共培养pH条件得到的黄瓜抗性芽诱导率不同。当pH为5.8时，黄瓜抗性芽诱导率最低，仅为22.59%。而pH为5.2时黄瓜抗性芽诱导率最高，为31.65%，但与共培养pH为5.5时的诱导率差异并不显著。因此可得出结论，pH为5.2～5.5的共培养基较适宜黄瓜转化。

3 讨 论

乙酰丁香酮是一种酚类化合物，其主要作用机理是通过诱导农杆菌Vir区基因的活化和表达，将T-DNA区从T两侧25 bp边缘序列中切割下来，促进了DNA的转移，使农杆菌T-DNA更易进入植物基因组并与其整合[10]。根据乙酰丁香酮的作用机理在使用过程中一般分为菌液中添加、共培养基中添加以及在菌液和共培养基中共同添加3种方法，如在蓝猪耳遗传转化时在根癌农杆菌菌液中加入100 μmol·L-1乙酰丁香酮，可使转化芽诱导率从5.76%提高到12.1%[11]；在研究杉木转基因时，在共培养基中加入80 μmol·L-1乙酰丁香酮，Kan抗性芽的产生频率比对照有了明显提高[12]。当然，还有一些其他有效利用乙酰丁香酮的方法，如在甘薯外植体伤口处滴加乙酰丁香酮也可显著提高抗性芽获得率[13]。本研究分别在侵染菌液和共培养基中添加了一定浓度的乙酰丁香酮，结果表明，与对照相比，这2种方法均可显著提高黄瓜抗性芽的诱导率。

在遗传转化过程中，不同物种的最适乙酰丁香酮浓度也不尽相同。在黄柏遗传转化时加入60 μmol·L-1乙酰丁香酮转化率最高[14]，向日葵遗传转化共培养基中加入100 μmol·L-1乙酰丁香酮最有利于提高转化率[15]，而丹参遗传转化共培养基中乙酰丁香酮的最适浓度为400 μmol·L-1[16]。本文对黄瓜最适的乙酰丁香酮浓度进行了探索，发现加入100 μmol·L-1的乙酰丁香酮可大幅提高黄瓜抗性芽的诱导率。

pH值的高低对乙酰丁香酮的诱导效果也有着明显的影响，从理论上讲，含乙酰丁香酮的培养基pH为5.0～5.5时，乙酰丁香酮的诱导效果较好。前人研究表明[17]，乙酰丁香酮在pH值5.2的条件下转化效果最好。本文研究了pH值对黄瓜遗传转化的影响，试验结果表明共培养pH 5.2时黄瓜的抗性芽诱导率最高，但其对于黄瓜抗性芽诱导率影响并不显著。

本文对黄瓜遗传转化过程中乙酰丁香酮的使用进行了较为系统的研究，进一步优化了黄瓜的遗传转化体系，为推动黄瓜转基因工作的前进奠定了坚实的基础。

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