基于免培养技术的食用菌病害微生物rDNA测序及初步分析

高能 姚强 宫志远等

作者简介：高 能（1986-），女，硕士研究生，主要从事食用菌栽培、遗传育种及食用菌病害研究。

通讯作者，E-mail：sdgzy2656@126com

摘要：采用CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒法提取四种主要食用菌病害组织样品的宏基因组DNA，用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对样品的基因组DNA进行PCR扩增、连接、转化并进行单克隆测序。每对引物随机挑取20个阳性克隆的rDNA序列进行比对，并对病害微生物的亲缘关系进行了初步分析，结果表明四种病害样品中两种为细菌性病害，两种为真菌性病害。

关键词：免培养；食用菌病害；rDNA 序列分析

中图分类号：Q789 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2013）06-0011-05

食用菌病害研究的传统检测方法主要包括分离、纯化、显微观察、染色技术、生理生化测定等[1]，所需时间长，准确性较低，往往需要结合其他鉴定技术（如PCR等分子技术）来提高其准确性。

自Pace等[2]首次提出环境宏基因组学、Handelsman等[3]提出基因组的定义以来，宏基因组学已作为新的分子生物学方法，成功应用于土壤[4]、海洋[5]环境微生物及消化道等菌群[6，7]的多样性研究中。宏基因组技术是以样品中的微生物群体总基因组作为研究对象，利用测序分析等生物信息学方法，基于非培养方式进行微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系等的研究。本试验基于免培养技术直接提取病害样品的宏基因组DNA，以16S rDNA/18S rDNA为靶基因进行病害微生物鉴定及亲缘关系初步分析，为食用菌病害的分子检测方法研究提供了依据。

1 材料与方法

11 试验材料

111 材料 样品1为平菇黄腐病病样（PG，图1A），采自济南平阴县孔村镇食用菌基地；样品2为双孢菇褐斑病病样（SBG，图1B），采自菏泽市定陶县马集乡牛杨村双孢菇种植基地；样品3为鸡腿菇黑头病病样（JTG，图1C），采自济南平阴县孔村镇食用菌基地；样品4为金针菇疑似胡桃肉状菌病病样（JZG，图1D），采自济南遥墙食用菌种植基地。

112 试剂 CTAB、Tris碱、EDTA、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、Taq PCR Master Mix、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒等分子试剂，均购自上海生工生物工程有限公司。

113 引物 细菌16S rDNA通用引物[8]：XF： 5′-AGGCCTAACACATGCAAGT-3′，XR： 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′；真菌18S rDNA通用引物[9]：ZF： 5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′，ZR： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；pUCm-T载体引物：TF： 5′-GTTGTAAAACGCAGGCCAG-3′，TR： 5′-CAGGAAACAGCTATGA-3′。引物合成及基因测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

12 试验方法

121 总基因组DNA提取 将所采集样品的病害部位分离备用，采用CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒法提取基因组DNA[10]。

122 PCR扩增及纯化 分别利用16S rDNA/18S rDNA通用引物对各个样品总基因组DNA进行PCR扩增，扩增体系按照试剂盒说明。PCR扩增条件：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，50～55 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃延伸10 min。并将其产物纯化，具体步骤参照试剂盒使用说明。

123 连接转化 参照T-载体PCR产物克隆试剂盒方法，将纯化的PCR产物与pUCm-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α。

124 菌落PCR检测 利用pUCm-T载体的引物，根据单菌落PCR检测法[11]对从含有Amp的LB平板上挑取的单菌落进行PCR扩增，检测是否为阳性克隆。反应体系（25 μl）参照Taq PCR Master Mix使用说明。反应条件：96℃预变性10 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。

125 序列分析 每个样品每对引物随机挑选20个阳性克隆进行测序。在GenBank中进行Blast序列比对，从基因数据库中下载病原菌属中代表种的16S rDNA或18S rDNA序列，利用MEGA 505等软件对所得序列及其它常见食用菌病原微生物模式种的序列进行初步的亲缘关系分析，构建病原菌属的系统发育树（N-J树）。

2 结果与分析

21 宏基因组DNA的提取

由图2可知，所得病害样品的宏基因组DNA片段比较完整，条带清晰，杂质含量较少，表明提取效果好，可以进行后续试验。

22 单菌落PCR验证

利用载体引物TF与TR对随机挑取的单菌落进行PCR扩增，10%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果表明，均能够扩增出与预计大小（16S rDNA约为510 bp，18S rDNA约为420 bp）相符的单一核苷酸片段（图3、图4）。

23 序列分析

样品1平菇黄腐病的测序结果经比对表明，20条真菌序列均与平菇Pleurotus ostreatus相关；细菌序列中荧光假单胞杆菌Pseudomonas fluorescens相关序列15条，鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp相关序列5条。比对结果用MEGA 505软件分析，从构建的N-J树（图5）可以看出，seq PG001与荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens）的同源性较高，确定该菌群属于荧光假单胞杆菌。有报道称荧光假单胞杆菌可引起平菇的黄腐病[12]，鞘氨醇杆菌大量存在于环境中，目前还未有鞘氨醇杆菌能够引起平菇等食用菌病害的报道。

样品2双孢菇褐斑病的序列比对结果表明，细菌序列中假单胞杆菌Pseudomonas sp相关序列12条，鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp相关序列5条，土地杆菌Pedobacter sp相关序列3条。将对比结果构建N-J树（图6），结果表明，seqSBG001与假单胞杆菌（Pseudomonas sp）的同源性较高，seqSBG002与鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp）的同源性较高，seqSBG003与土地杆菌（Pedobacter sp）的同源性较高。宋金俤发现双孢菇褐斑病的病原菌为假单胞杆菌[13]，土地杆菌普遍存在于土壤中，可由栽培覆土带入，目前还未有鞘氨醇杆菌或土地杆菌引起双孢菇等食用菌病害的报道。

样品3鸡腿菇黑头病的序列比对结果表明，所测得的细菌序列均与假单胞杆菌Pseudomonas sp相关；真菌序列中与轮枝菌Lecanicillium sp和鸡腿菇Coprinus comatus相关的序列各有10条。构建N-J树（图7）进行分析，seqJTG001与轮枝菌（Lecanicillium sp）的同源性较高，同时由于假单胞杆菌可引起食用菌子实体腐烂，表面发粘并且有臭味，而鸡腿菇黑头病的腐烂属于干腐型，表面呈灰状，无味，因此，可以初步判断鸡腿菇黑头病的病原菌为轮枝菌（Lecanicillium sp）。

样品4金针菇疑似胡桃肉状菌病的序列比对结果表明，20条真菌序列中与Pezizomycetes sp相关的序列有15条，与金针菇Flammulina velutipes相关的序列有5条；细菌序列中与鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp有关的序列16条，其它不可培养的细菌的序列4条。由图8的N-J树分析得出，seqJZG001与Pezizomycetes sp的同源性较高，seqJZG002与金针菇（Flammulina velutipes）的同源性较高，seqJZG003为不可培养的细菌（Uncultured bacterium），seqJZG004与鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium sp）的同源性较高。Pezizomycetes sp 属子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），盘菌纲（Pezizomycetes）。由于病害发生于金针菇发菌期，初期为白色，后逐渐变为褐色，菌丝表面发干，而细菌在生长过程中会产生粘液，因此，初步推测病原菌为Pezizomycetes sp。据黄年来等[14]报道，引起胡桃肉状菌病的病原菌为胡桃肉状菌（Diehliomyces microsporus），本研究未能分离出相关序列。

3 讨论

荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens）和假单胞杆菌（Pseudomonas sp）主要寄生在食用菌的子实体上，起初为小的黄色、褐色斑点，慢慢地发展成大块，整个菇体都变成黄褐色，最终使食用菌子实体腐烂。金针菇、滑菇、杏鲍菇、平菇及双孢菇等腐烂病主要是由荧光假单胞杆菌和假单胞杆菌引起的[12～15]，如平菇黄斑病、双孢菇干腐病的病原都是假单胞杆菌。鸡腿菇的黑头病是一种真菌性的病害，发病率较高，严重影响了鸡腿菇的生产。金针菇病害也多是真菌性的病害，主要发生在金针菇发菌期，抑制金针菇菌丝生长，使其无法出菇，最终导致减产甚至绝收。关于本试验得出的轮枝菌（Lecanicillium sp）和Pezizomycetes sp为病原菌的研究仍少有报道。

能够简便、快速、准确地检测食用菌病原菌是控制病害、防止病害快速蔓延的有效方法。相对传统微生物分离等方法，宏基因组等分子生物学技术为病原菌的快速检测开辟了新的途径。利用PCR技术对病原菌进行检测与诊断有着较高的特异性和灵敏度的要求，引物设计对PCR是至关重要的[16～18]。夏明星等利用荧光PCR技术快速准确地检测出引起番茄细菌性溃疡病的密执安棒杆菌密执安亚种[19]；张祥林等利用细菌16S rDNA研究西瓜细菌性果斑病，设计了能够检测病原菌的特异性引物[20]；宏基因组的研究也已应用于甘蔗、小麦、棉花、柑桔等病害的研究[21～24]。因此，建立基于免培养技术、快速高效的食用菌病害检测方法，为进一步的食用菌病害的防治研究奠定了基础。参 考 文 献：

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