斑马鱼一种母源凝集素基因zfol的原核表达和抗体制备分析

杜嫚　王红莹

摘 要：zfol是斑马鱼的一种母源凝集素基因。从斑马鱼胚胎中提取RNA，应用RT-PCR从斑马鱼中得到zfol的基因片段，重组入原核表达载体pEASY-E2中得到重组质粒，并测序鉴定其序列的正确性，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中诱导表达，并纯化蛋白，利用纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子，制备斑马鱼母源凝集素Zfol蛋白的多克隆抗体，利用Western-blot方法检测抗体特异性，得到特异的多克隆抗体，为进一步研究母源凝集素基因zfol的功能奠定了基础。

关键词：斑马鱼；zfol；原核表达；多克隆抗体

中图分类号 S965.299 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）06-14-03

免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统，保卫机体免受疾病的危害，免疫系统以基本的免疫系统（以酶的形式存在于细菌中免受噬菌体感染）或者复杂的免疫系统（人体内）存在于所有生物体中。另外一些基本的免疫机制是从古老的真核生物演变而来，存在于后代生物中，例如植物和昆虫，包括吞噬作用，抗菌类多肽如防卫素，以及补体系统[1-2]。大多数鱼类在尚未发育完全时，其对外界病原微生物仍然具有一定的抵御能力，这种抵御能力主要来自于自身非特异性免疫和母源性免疫。而存在于卵母细胞中的凝集素、溶菌酶等物质被认为是来自于母体的免疫物质，并且在鱼类胚胎发育中可能发挥重要作用[3]。目前对鱼类胚胎发育早期的先天免疫机制的研究已经成为鱼类免疫学研究的重点领域，主要是由于鱼类在胚胎发育早期的致死率较高[4-5]。

斑马鱼作为新型模式生物，具有以下优点：成年鱼个体小，易于饲养；胚胎体外发育，易于观察和操作；品系资源丰富；发育快速、性成熟期短、繁殖力强，以利于提供充足的实验材料；较完善的胚胎和遗传学操作技术，如转基因、基因过表达等技术。近年来随着对斑马鱼研究的不断深入，其应用范围已经涵盖鱼类免疫系统发生、病原和宿主研究的各个方面[6-7]。笔者试图通过构建母源凝集素zfol基因原核表达载体，制备多克隆抗体，并用此抗体检测斑马鱼中该基因的表达，为进一步研究该基因的功能提供条件，也为深入研究母源凝集素基因在鱼类胚胎发育早期的免疫保护作用中扮演的角色奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 斑马鱼（Danio rerio），选取生命力旺盛，具有活跃繁殖力的适龄斑马鱼，由中国海洋大学分子医学生物学实验室提供。

1.2 酶及相关试剂 限制性内切酶购自NEB；T4连接酶购自Promega；胶回收、质粒提取等相关试剂盒购自TaKaRa；RNA提取试剂盒购自Fastagen公司；His Bind Purification kit购自Novagen公司；弗氏佐剂购自Sigma公司；DMEM购自Gibco公司。

1.3 菌株及质粒 大肠杆菌BL-21由本实验室保存；原核表达载体pEASY-E2由中国海洋大学分子医学生物学实验室提供。

1.4 方法

1.4.1 引物设计 5引物（5-GGGAATTCCATATGGACTGTACTATAATGAATGG-3），3引物（5-CCGCTCGAGCCGACTCACACCAACTCTTT-3），5引物中含有NdeI酶切位点CATATG，3引物中含有XhoI酶切位点CTGGAG，用于扩增得到zfol的目的基因片段。

1.4.2 总RNA的提取和目的片段的扩增 取斑马鱼早期胚胎数十枚，用RNA提取试剂盒提取总RNA，然后逆转录合成cDNA：（1）体系一：oligo dT 1μL，mRNA 2μg，加Rnase free ddw至13μL，70℃孵育5min；（2）体系二：逆转录酶1μL，buffer 5μL，dNTP 5μL，RNA酶抑制剂1μL；（3）体系一孵育完成后，将体系二加入其中，震荡混匀，42℃孵育60min，然后70℃孵育15min。以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，进行35个循环；72℃延伸10min。

1.4.3 原核表达质粒的构建及鉴定 zfol基因PCR扩增结束后，将PCR产物纯化，用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，提取原核表达载体pEASY-E2质粒，同样用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，酶切完成后，回收酶切产物，将zfol基因片段与表达载体pEASY-E2用T4连接酶连接起来，转化感受态细胞DH5α，测序鉴定出序列正确的克隆。

1.4.4 重组质粒在大肠杆菌中的表达和纯化 选取测序无误的克隆，提质粒转化大肠杆菌BL21，挑单克隆并培养至OD600≈0.5，加入终浓度为1mmol的IPTG，37℃条件下诱导4h后离心并收集菌体，4℃、12 000g离心1min，离心弃上清，将菌体沉淀重悬于100μL 2×上样缓冲液（100mmol/L Tris，pH6.8，200mmol/LDTT，0.2%溴酚蓝，20%甘油，4%SDS）。菌悬液沸水浴煮5min，立即冰浴2min，4℃离心5min，取20μL样品上样，进行SDS-PAGE电泳分析。用亲和素-生物素亲和层析纯化原核表达载体表达的蛋白。

1.4.5 多克隆抗体的制备及特异性检测 纯化后的zfol蛋白与弗氏佐剂等体积混合乳化，对免疫动物日本大耳白兔的背部皮下多点注射。第1次注射2～3周后再加强免疫3次，各次剂量为第1次注射的1/4，每次间隔10d，后3次以弗式不完全佐剂乳化样品。在第4次注射后10d经心脏取血，按常规方法分离血清。取未经IPTG诱导和经IPTG诱导的重组质粒的菌体总蛋白进行Western-blot检测抗体的特异性，SDS-PAGE电泳分离。电泳结束之后，切下含有目的蛋白的PAGE胶，通过电转印将蛋白转移到PVDF膜上，转好的膜经TBS洗涤后，在5%的脱脂奶粉中封闭至少2h；将封闭好的膜用TBST洗涤后，加一抗孵育，zfol多克隆抗体为一抗（1：200稀释），4℃摇床孵育过夜；TBST洗膜5min×4次，加二抗（羊抗兔1：1 000）孵育至少2h；TBST洗膜5min×4次，然后用ECL显色液显色，用凝胶扫描分析系统扫描存图，并用分析软件GENETOOL分析结果。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取和zfol的扩增 取斑马鱼早期胚胎30枚左右，用RNA提取试剂盒提取总RNA，用于反转录合成第一链cDNA，从图1（A）中可看出28S、18S和5.8S 3条RNA带型，提取的RNA能够用于反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，用设计好的引物扩增zfol基因片段，zfol基因cDNA全长为771bp，所扩增zfol的基因片段长度为579bp，从图1（B）可以看出，扩增大小在预期片段大小范围内。

2.2 原核表达质粒的构建与鉴定 将zfol基因扩增后的片段经处理后，连接到表达载体中，用融合蛋白的形式表达。通过测序验证所构建的原核表达质粒是否正确，图2中的测序结果与zfol基因序列比对，结果一致。

2.3 zfol多克隆抗体的制备和特异性分析 用Western免疫印迹检测抗血清的特异性。结果显示，以未经IPTG诱导的重组质粒的菌体蛋白作对照，没有信号，而经IPTG诱导的重组质粒的菌体蛋白能够检测到信号，抗体能特异地识别28kD的zfol蛋白（图3）。

3 结论与讨论

凝集素在低等脊椎动物和无脊椎动物中是种重要的免疫介质，并且它们能够结合碳水化合物，这些碳水化合物涉及到对细胞壁的附着，因此，凝集素能阻止这种附着作用及随后的入侵。对凝集素在早期胚胎发育中免疫保护作用的深入研究，有利于降低鱼类在早期胚胎发育时期的死亡率。zfol作为斑马鱼的一种母源凝集素基因，有可能在早期胚胎发育过程中发挥免疫保护作用。在本研究中，笔者原核表达了从斑马鱼中鉴定出来的一种母源凝集素基因zfol，并成功制备了多克隆抗体。该多克隆抗体的制得为进一步研究zfol在斑马鱼胚胎发育早期中发挥的重要作用奠定了基础。

参考文献

[1]Pradipta R. Rauta，Bismita Nayak，Surajit Das. Immune system and immune responses in fish and their role in comparative immunity study： A model for higher organisms[J]. Immunology Letters，2012（148）：23-33.

[2]Beck G，Gail SH.Immunity and the invertebrates[J]. Sci Am，2007，60：6.

[3]王志平. 斑马鱼（Danio rerio）母源性补体因子的传递和免疫功能以及补体系统的个体发育[D]. 青岛：中国海洋大学，2008.

[4]Bergljot Magnadottir. Innate immunity of fish （overview）[J]. Fish & Shellfish Immunology，2006，20：137-151.

[5]P. Swain，S.K. Nayak.Role of maternally derived immunity in fish[J].Fish & Shellfish Immunology，2009，27：89-99.

[6]John F. Rawls，Michael A. Mahowald， Andrew L. Goodman，et al. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut[J]. PNAS May1，2007，18：7 622-7 627.

[7]孙智慧，贾顺姬，孟安明. 斑马鱼：在生命科学中畅游[J]. 生命科学，2006，18：431-436.

（责编：徐世红）