荧光定量PCR检测HBV—DNA与ELISA法乙肝免疫学检测的探讨

黄静

[摘要] 目的 探讨荧光定量PCR法检测HBV-DNA与ELISA法乙肝免疫学指标的相关性。 方法 采用ELISA 法和荧光定量PCR技术分别对353 例乙型肝炎患者血清进行免疫学指标的检测及HBV-DNA 的定量检测。 结果 ELISA法呈大三阳组患者的HBV-DNA阳性率及病毒平均拷贝数均高于小三阳组；HBeAg（+）组的阳性率及病毒平均拷贝数高于HBeAg（-）组；HBeAb（+）组有较低的HBV-DNA阳性率及病毒平均拷贝数。 结论 HBV-DNA 的含量与乙肝免疫学检测结果具有相关性。临床上应注意两者联合应用。

[关键词] HBV-DNA；ELISA法；乙肝；免疫标志物

[中图分类号] R512.62 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）06-110-03

乙型肝炎是目前最常见的威胁人类健康的传染病之一。我国是乙型肝炎的高发区，并且近年来其发病率有上升趋势[1]。因此做好乙肝的检测对于传染病的防控及临床诊治有重要的意义。目前临床最常用的乙肝筛查及诊断治疗的方法是检测乙肝免疫学指标，即乙肝五项指标。而在免疫指标检测方面最常用的是酶联免疫吸附试验（ELISA）法，它反映人体对HBV的免疫反应状态，具有快速、价廉、简便的特点，适合乙肝的大批量筛查及快速诊断；但是不能直接反映HBV在患者体内的复制情况。而荧光定量PCR检测HBV-DNA法可直接监测血清中乙肝病毒核酸的载量，是判断病毒复制活跃程度及是否具有传染性的可靠依据，对临床抗病毒治疗及判断预后均具有指导意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011年6月～2012年6月在本院门诊、住院及健康查体的HBsAg（+）标本共353例，其中女157例，男196例。按患者的乙肝病毒血清免疫学标志物组合分为6组：A组（大三阳）HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+），共112例；B组（小三阳）HBsAg（+）、HBeAb（+）、HBcAb（+），共93例；C组 HBsAg（+）、HBeAg（+），共45例；D组 HBsAg（+）、HBeAg（-），共31例；E组 HBsAg（+）、HBeAb（+），共53例。

1.2 研究方法

1.2.1 HBV免疫学检测 采用用酶联免疫吸附试验（ELISA）法。试剂由上海科华生物工程公司生产，使用BIO-RAD Model 680酶标仪比色来判断结果。操作过程及结果判读按试剂说明书进行。

1.2.2 HBV-DNA的测定方法 采用荧光定量PCR测定HBV-DNA。实时荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司的AB I7500 型，HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒也由上海科华生物工程公司提供，本试剂的定量测定范围为103～107。操作方法严格按说明书进行，结果真实可信。

1.3 统计学处理

采用SPSS15.0软件，运用x2检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大三阳患者（A组）与小三阳患者（B组）的HBV-DNA定量比较

结果显示：大三阳组的HBV-DNA阳性率为95.54%。

小三阳组的HBV-DNA阳性率为52.69%。其阳性率差异具有统计学意义（P<0.05）。并且大三阳组的HBV-DNA的平均拷贝数为7.02×107，明显高于小三阳组。见表1。

2.2 HBsAg（+）、HBeAg（+）患者（C组）与HBsAg（+）、HBeAg（-）患者（D组）的HBV-DNA含量结果比较

如表2所示：C组HBV-DNA阳性率为71.11%。D组的HBV-DNA阳性率为22.58%，其阳性率差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.3 HBsAg（+）、HBeAb（+）患者（E组）与HBsAg（+）、HBeAg（+）患者的HBV-DNA含量比较

表3显示E组的阳性率阳性患者的平均拷贝数均低于C组（P<0.05）。

3 讨论

乙型肝炎病毒（HBV）感染是目前世界范围内的严重公共卫生问题。它传染性强，发病率高，且感染者部分易转变成慢性肝炎，并容易继发肝硬化、肝癌等疾病[2]。我国属于“乙肝大国”，据我国卫生部1992～1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查公布的数据显示[3]：我国人群乙肝病毒携带率为9.75%，总数约为1.2亿，严重危害我国人民的生命健康。因此，采取有效的方法做好乙肝的检测对于及时发现患者、切断传播及进行临床诊治均有重要的意义。

目前血清标志物的检测方法有酶联免疫法（ELISA法）、化学发光法、实时荧光定量PCR法、放射免疫法、胶体金法、免疫层析法等[4]。这其中ELISA法因其操作简单、成本低廉，、方便快速、灵敏度和特异度较高等特点得到了临床广泛应用。是目前对HBV感染的常规检查方法。但ELISA法的缺点是只能得到定性结果，是HBV感染的间接依据，不能及时、动态地反映体内病毒复制情况及传染危险程度。而实时荧光定量PCR法进行HBV-DNA定量检测是HBV感染最直接的指标，并且其特异性强、灵敏性高[5]，能直接反映乙肝病毒的复制水平及传染性。但是HBV-DNA检测却不能明确非复制状态的感染。故临床上常常进行两者联合检测。

本次检测结果显示，在乙肝病毒感染者中“大三阳”患者的PCR检测结果符合率极高，达到95.54%；且病毒含量高，平均拷贝数为7.02×107，表明病毒复制活跃，传染性极强，与此前相关报道基本一致[6-7]。这说明乙肝免疫标志物的组合HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+）能够很好地反映乙肝的感染及传染情况，临床意义明确。小三阳组HBV-DNA阳性率为52.69%，平均HBV-DNA拷贝数为4.21×105，阳性率及平均拷贝数均低于大三阳组。这可能与HBeAg转阴而产生HBe-Ab有关，患者体内乙肝病毒含量下降，传染性降低。但这并不表示患者体内已没有病毒复制；小三阳患者有半数以上体内仍有较高病毒载量，且有部分（本研究结果为23.66%）患者体内有很高的病毒载量（>1×107）。而HBsAg（+）、HBeAg（+）患者与HBsAg（+）、HBeAg（-）患者的HBV-DNA含量比较类似于大三阳与小三阳组的比较，结果显示HBeAg（+）组的DNA阳性率及平均拷贝数均高于HBeAg（-）组。这再次表明HBeAg的存在与HBV-DNA的含量具有相关性。何大源等[8]研究表明，高水平的HBeAg是病毒复制的标志。而HBeAg转阴表明患者体内的HBV-DNA的复制正在减少，这有利于了解患者的病情并对抗病毒的疗效检测提供了参考依据[9]。而对HBsAg（+）、HBeAb（+）患者与HBsAg（+）、HBeAg（+）患者进行的检测结果证明HBeAg（+）的出现表明患者的病毒复制较少，传染性减弱。

综上所述，判断乙型肝炎患者的病毒复制情况及是否具有传染性方面，荧光定量PCR检测HBV-DNA法要明显优于ELISA法；但在病毒感染分析、疾病进程及HBV-DNA阴性患者的病情判断方面，ELISA法为代表的免疫学指标有着不可替代的作用。在临床工作中我们既需要应用免疫学指标进行乙肝病毒感染的筛检、快速诊断及病情进展的评估，也需要相对精确了解体内HBV的复制水平；两者结合对早期诊断HBV感染、判断是否进行抗病毒治疗及疗效观察提供科学的实验依据，从而达到降低感染率、减缓乙肝进程、提高患者生存质量的目的。

[参考文献]

[1] Jinlin Hou，Zhihua Liu，Fan Gu.Epidemiology and Prevention of Review Hepatitis B Virus Infection[J].Int J Med Sci，2005，2（1）：50-57.

[2] Xin Zheng，Klaus M. Weinberger，Ralph Gehrke，et al.Mutant hepatitis B virus surface antigens（HBsAg）are immunogenic but may have a changed specificity[J].Virology，2004，329：454-464.

[3] 中华人民共和国.2006～2010年全国乙型病毒性肝炎防治规划[S]. 2006-01-28.

[4] 赵秀英，陈俊梅，辛永梅，等.不同方法检测乙型肝炎病毒血清标志物的差异[J].肝脏，2008，13（4）：303-305.

[5] 熊英.乙型肝炎病毒敏感性指标检测的临床意义[J].中华医院感染学杂志，2011，21（14）：2962-2964.

[6] 陈伟，邓少丽，常晓松.定量PCR检测乙肝患者HBV2DNA及其意义[J].中国现代医学杂志，2003，13（13）：20.

[7] 刘宝芳.各型乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与临床的关系[J].中华肝脏病杂志，2002，10（1）：65.

[8] 何大源，黄玉嘉，杨波.乙型肝炎病毒载量与乙型肝炎两对半之间的关系[J].检验医学与临床，2007，4（9）：822-823.

[9] 张高明，张国明，马小波，等.乙型肝炎患者血清中抗原与病毒DNA关系探讨[J].检验医学与临床，2011，8（20）：42-43.

（收稿日期：2013-03-11）