shRNA病毒递送载体

杨洋?张均平?王明席?许瑞安

[摘要] RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种有力的基因沉默工具，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机制研究等领域广泛应用。RNAi可以用于鉴定药物靶标及治疗疾病，尤其是传统治疗手段无效的重大疾病。如何将双链小干扰RNA（siRNA）高效传递至体内靶细胞是RNAi成功用于疾病治疗的关键，也是目前研究的热点。由于病毒载体能高效转导多种细胞成为基因工程和基因治疗的主要载体。目前，越来越多的研究将病毒载体应用于介导RNAi，然而病毒载体存在靶向性差、生物安全性等问题。本文针对这些病毒载体的优劣进行归纳并指出今后改进的方向。

[关键词] RNA干扰；小干扰RNA；病毒载体；短发夹RNA

[中图分类号] R34 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）06-29-03

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。运用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，已广泛用于探索基因功能、传染性疾病和恶性肿瘤的基因治疗研究领域[1]。早期研究发现，直接瞬时转染外源性siRNA可以实现基因沉默。但siRNA稳定性差、效果短暂，因此需要寻找恰当的运载工具避免其降解并提高细胞摄取、正确的细胞内定位等。研究发现，将siRNA基因表达框构建到表达质粒中可以实现内源性表达[2]，但转染效率低、转基因表达短暂、生产成本高。病毒载体则无这些缺陷而得到广泛应用，目前主要有以下几种。

1 逆转录病毒载体

逆转录病毒（retrovirus，RV）是最早应用于RNAi的病毒类载体，其基因组包括5'和3'长末端重复序列（LTR）、紧靠5' LTR的包装信号及gag、pol和env三个结构基因。RV能够将小干扰RNA高效地传递到靶细胞、并稳定表达，多用于高通量分析、发现新基因和鉴别新基因功能。Schlabach

等[3]将shRNA文库构建到RV载体并转化到肿瘤细胞后，对不同类型肿瘤细胞的增殖和生存基因的影响不同，这一开创性研究结果补充了癌症基因组图谱，为个性化治疗癌症提供了新的方向。Silva等[4]通过对5种来自乳腺组织的6000～20 000种shRNA进行了基因组水平上的肿瘤特异性缺陷分析，发现了一批在细胞增殖和生存中起关键作用的基因，进而为从遗传学角度进行癌症联合治疗提供了可能。Aliya等[5]利用携带针对FAK的shRNA-RV感染人肝癌细胞株HCC-LM3，获得了FAK表达被稳定抑制的细胞株，细胞增殖和迁移能力明显被抑制。Brummelkamp等[6]将靶向致癌基因K-RASV12的shRNA-RV注射至小鼠体内，能够特异而稳定地抑制K-RASV12表达和肿瘤生长。这些研究为应用RV转运siRNA来治疗肿瘤提供了理论基础和实验依据。但是，RV因将自身基因组整合至宿主基因组上，近而存在诱发基因突变的风险。

2 慢病毒载体

慢病毒（lentivirus，LV）是逆转录病毒的一个亚纲，与其他逆转录病毒相比，其具有两组在其生命周期和致病性中扮演重要角色的基因，分别是辅助基因（vpr、vpu、vif、nef）和调节基因（tat、rev），它们位于两端的LTR之间。重组慢病毒载体的构建是尽可能避免经简单同源重组而产生具有复制能力的病毒。目前多采用四质粒转染的方法生产LV，调控元件如cPPT、WPRE的引入提高了LV的转导效率及基因表达效率；组织特异性启动子的加入使RNAi作用在特定组织中发生，为靶向基因治疗提供了理论基础。Huang等[7]构建靶向大鼠HSP27基因RNAi-LV，对PDGF诱导的HSP27磷酸化的抑制率为79.6%。Bahi等[8]发现通过立体定位注射表达靶向CD-81的shRNA-LV可以有效抑制CD-81的表达，且不会扩散到其他部位。LV仅限于局部给药方式，未见全身应用的研究报道。

3 腺病毒载体

腺病毒（adenovirus，AV）是一类无外壳的双链DNA病毒，AV基因分为早期基因（E1、E2、E3、E4）和晚期基因（L1、L2、L3、L4、L5）两类。目前世界上25%的基因治疗实验使用的是AV载体[9]。用于RNAi载体的主要是2型和5型腺病毒。第一代载体是将E1、E3去除其一或者同时去除，但在应用中会出现可复制AV、严重的宿主免疫反应；第二代AV载体同时去除E1、E4或E1、E2，虽然可以抑制病毒蛋白的合成，但仍存在免疫反应。目前，第三代腺病毒载体又被称为“裸腺病毒”，其中仅保留ITR和包装信号部分，可以容纳高达37 kb的外源基因。这种载体因无法在体内合成病毒性抗原，从而使机体的免疫反应极大降低。

Xia等[10]成功使用AV-RNAi的体内实验，通过局部定向注射将含有靶向绿色荧光蛋白（GFP）的发卡结构的AV体注入GFP转基因小鼠脑部，有效沉默了GFP的表达。虽然这一研究并没有采用致病基因，但可以证明基于RNAi进行脑部疾病治疗和脑功能研究是切实可行的。之后Chen等[11]利用AV携带编码AT1a/AT1b shRNA的DNA序列通过侧脑室进行定点注射，验证了AT1两个受体亚型的生理功能。有研究者[12]将miR-34a的前体片段构建到AV上，转导成神经管细胞瘤细胞，然后移植到裸鼠小脑，沉默了相关靶基因，并有效抑制了肿瘤的生长，实验结果显示对实验动物无明显毒副作用，为AV作为RNAi载体来治疗肿瘤提供了新的基础证据。虽然这种局部的AV-RNAi方式可以有效抑制肿瘤生长，但由于大多肿瘤不适合这种给药方式，因此不利于临床上的广泛应用。Gou等[13]采用了一种更方便于临床应用的给药方式，他们通过气管内喷雾方式将腺病毒导入大鼠，有效沉默膜联蛋白A2。AV载体转基因表达量高且容量大，实现多个shRNA串联表达来达到多靶点治疗效果是AV载体未来发展的主要方向。

4 腺相关病毒

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）属于依赖病毒属细小病毒科，是目前最具临床应用价值的病毒载体之一。野生型AAV普遍存在人体内，且无致病性。其基因组包括5'ITR（末端重复序列）、复制包装所需蛋白rep和cap、以及3'ITR。重组AAV载体（rAAV）是去除了rep和cap蛋白，仅保留病毒整合所必须的ITR区域。

使用AAV作为载体工具用于体内外RNAi研究已取得了许多令人振奋的研究成果。Liu等[14]将构建的rAAV-shRNA-LMP-1转染鼻咽癌C666-1细胞后，对LMP的抑制率超过90%，并能显著抑制癌的转移。Wang等[15]研究gp9与寒冷诱发的高血压、心脏病和肾脏疾病的关系。他们发现注射AAV2-shRNA-gp9可以极大抑制寒冷所诱发的心脏、肾脏以及主动脉内的gp9蛋白表达上调，有效抑制相关疾病的发作。Suhy等[16]设计了一种可以表达3种靶向丙肝病毒基因组保守区域的shRNA，使用rAAV8病毒作为载体经静脉注射后，有效抑制了猕猴体内的病毒复制，且几乎没有肝毒性。基因药物临床应用多采用注射方式，患者依从性差。口服给药以其使用方便，价格低廉等优点越来越受到重视。本课题组首次利用乳糖不耐受大鼠模型对口服rAAV载体的可行性进行了研究，口服给药后，外源基因可在肠道深层细胞中长期高效表达，显著提高大鼠对乳糖的消化和吸收能力[17]，为基于病毒载体的RNAi药物通过胃肠道给药提供了理论和实践基础。

rAAV载体不包含AAV的rep和cap基因，其对基因组的整合效率下降、无法传递到子代细胞，不适合肿瘤等分裂细胞的长效基因替代治疗。如何降低rAAV载体的毒性和免疫性还需要很多研究工作。另外，目前规模化制备水平低也是临床应用的主要障碍之一。这些问题的克服将会更有利于AAV介导的RNAi治疗在临床中的广泛应用。

5 杆状病毒

昆虫杆状病毒（Baculovirus，BV）是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，其基因组大小为80～180 kb，可能成为体内传递shRNA的载体，目前仍处于早期研发试验阶段。BV可以整合大量的遗传信息，为组合基因疗法提供了可能。此外，在哺乳动物细胞中BV无法复制和表达病毒蛋白，因此在人体应用是安全的。基于shRNA的BV载体目前用于靶向致病性病毒，如丙肝病毒复制[18]以及流感病毒A和B[19]。然而，BV转导载体是短时间的表达，因此这种效应是短暂的。该病毒用于人类基因治疗还有很长的一段路要走。

6 自身复制病毒

有效的基因治疗不仅需要将治疗基因有效传递到靶细胞，同时也需要基因能够持续表达。自身复制病毒最大的优势在于，每一个被病毒感染的细胞产生出大量的携带治疗基因的病毒，并侵染到周围的肿瘤组织，从而达到更加持久和高效的治疗效果。这种病毒被称为溶瘤病毒，是癌症治疗的新方法。目前通过生物工程的手段，已经设计制造了几种基因修饰的病毒并用于体外研究如单纯疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒[20]，这些病毒拥有内在的溶瘤细胞活性，转导细胞后会引起宿主细胞死亡，从而增强了抗肿瘤活性。如何使复制病毒在肿瘤组织中选择性复制，而在正常组织中不复制，将是今后一段时间需要解决的主要问题。

7 问题与展望

病毒载体是体内运送RNAi最有效的手段，不同的病毒载体具有自身的优势与劣势，如何根据不同疾病甚至不同病人的治疗需要选择最适合的载体就显得十分重要的。目前制约病毒载体应用的主要问题是免疫原性和组织特异性，这些问题或许可以通过构建杂合型载体，甚至将病毒载体同非病毒传递技术联合运用等方法解决。随着作用基因沉默机制的阐明、转运载体同宿主相互作用机制研究的深入，将有更多特异、高效、安全的新型病毒载体出现。而提高病毒载体组织特异性和减少宿主免疫反应将是今后一段时间研究的重点，这些问题的彻底解决必将催生大量的相关临床实验的有序展开，以造福于人类健康。

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（收稿日期：2013-03-06）