柑橘组织中橙皮苷的分析

王建安　江海　陈文强等

摘要：采用超高效液相色谱法对陕西汉中柑橘（Citrus reticulata）的皮、肉、橘络、橘子4个组织中的橙皮苷含量进行测定。结果表明，柑橘中的橙皮苷与其他成分均能达到有效分离，橘皮、橘肉、橘络、橘子中橙皮苷含量分别为332.21、50.85、581.34和641.73 mg/kg。该方法能够用于柑橘及相关产品中橙皮苷的分析检测。

关键词：柑橘（Citrus reticulata）组织；橙皮苷；测定；超高效液相色谱

中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1659-04

柑橘（Citrus reticulata）是芸香科（Rutaceae）柑橘亚科（Subfam. Aurantioideae Engl.）柑橘属（Citrus L.）的一类水果，以柠檬、柚、葡萄柚、甜橙、宽皮橘为主要栽培品种[1]，柑橘果树主要分布于热带、亚热带等135个国家和地区，是世界上种植面积和产量均最大的水果。国际柑橘年贸易额为80亿美元，全世界柑橘常年总产量6 000万～10 000万t，仅次于小麦和玉米，是第三大国际贸易农产品[2-4]。

中国是世界上柑橘栽培最早的国家，已有3 000多年的栽培历史，战国时期屈原所作《橘颂》中有“后皇嘉树，橘徕服兮。受命不迁，生南国兮”的诗句，表明中国南方在2 000多年前开始广泛栽培柑橘。现今我国柑橘常年种植面积居世界第一，产量居世界第一，在农业生产中占有重要地位。柑橘在我国主要分布在北纬16°-37°，包括浙江、福建、湖南、四川、广西、湖北、广东、江西等19个省市、自治区都有柑橘栽培，但柑橘的经济栽培区主要集中在北纬20°-33°，海拔700～1 000 m以下的亚热带、热带地区，其中长江中上游柑橘带、赣南-湘南-桂北柑橘带、浙南-闽西-粤东柑橘带为我国柑橘优势栽培区。

柑橘的营养成分十分丰富，作为一种经济作物，全果均可利用。柑橘主要的功能成分有矿物质、维生素、纤维素、胡萝卜素和黄酮类物质等。目前已从柑橘中鉴定出来的黄酮类化合物有60余种，最常见的为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、芸香苷等二氢黄酮类化合物[5]。其中对柚皮苷的关注及研究较多[6-11]，而对橙皮苷的研究报道较少。

橙皮苷（Hesperidin）又名橘皮苷、橘皮甙，是橙皮素与芸香糖形成的糖苷，为二氢黄酮衍生物，广泛存在于豆科、唇花科、碟形花科、芸香科柑橘属植物中，具有维持血管正常渗透压、降低血管脆性、增强毛细血管韧性、缩短出血时间等作用。橙皮苷不仅具有降低人体内胆固醇作用，还有抗病毒、提高免疫力的功效，具有消炎、抗氧化、抗菌、抗癌、防辐射、保护心血管系统等药理活性[12-14]。

目前橙皮苷分析研究的方法有光谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、色谱-质谱联用法等[15]。超高效液相色谱（UPLC）作为一种高效分析技术，在柑橘有效成分分析方面报道较少，本研究采用超高效液相色谱对陕西汉中所产柑橘不同组织中的橙皮苷进行分析，通过对柑橘不同组织中橙皮苷的分析，为柑橘类产品加工原料的选择及地方柑橘资源的开发利用、柑橘品种选育及遗传亲缘关系研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 陕西汉中种植的主要柑橘品种宫川，取橘皮、橘肉、橘络、橘子经烘箱50 ℃烘干、粉粹，过60目筛备用。

1.1.2 主要仪器和试剂 Waters ACQUITY-UPLC（Waters公司）配PDA检测器；SHIMADZU AUY220电子天平（日本岛津公司）；KQ100-DA超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；101-3A型电热恒温鼓风干燥箱（沪南电炉烘箱厂）；ZN-02中草药粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）。

橙皮苷（上海同田生物技术股份有限公司，纯度为99.8%）；甲醇（分析纯，天津市登峰化学试剂厂）；乙腈（色谱纯，Burdick & Jackson公司）；纯水（杭州娃哈哈饮料有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准品溶液的制备 称取橙皮苷标准品1.00 mg，用甲醇溶解并定容于10.0 mL的容量瓶中，得到100.0 μg/mL的橙皮苷标准母液，备用。

1.2.2 检测波长的选择 吸取0.50 mL 100.0 μg/mL橙皮苷标准品溶液，用甲醇溶解并定容于10.0 mL，进行光谱扫描，选择合适的检测波长。

1.2.3 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC&BEH C18色谱柱（50.0 mm ×2.5 mm，1.7 μm）；流动相：A为乙腈，B为纯水；采用梯度洗脱，A梯度：10%（0 min）-10%（1 min）-40%（5 min）-10%（6 min）；检测波长283 nm；流速为0.3 mL/min；进样量5 μL；PDA检测器；柱温30 ℃。

1.2.4 标准工作曲线的制备 分别吸取橙皮苷标准母液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用甲醇定容于10.0 mL容量瓶，得到浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL的橙皮苷标准工作溶液，分别经0.22 μm微孔滤膜过滤，按上述色谱条件依次进样。测定各溶液的色谱峰面积，绘制标准工作曲线。

1.2.5 样品溶液的制备 精确称取橘皮、橘肉、橘络、橘子各0.50 g，加入15.0 mL甲醇于50.0 mL具塞三角瓶中超声提取40.0 min，过滤，残渣再超声提取3次，每次用10.0 mL甲醇，各提取10.0 min，合并提取液，用甲醇定容至50.0 mL容量瓶，经0.22 μm微孔滤膜过滤后上机检测。

1.2.6 精密度试验 按上述方法制备橘皮样品溶液，连续进样5次，每次进样5.0 μL。测定橙皮苷的峰面积，计算相对标准偏差（RSD）以考察方法的精密度。

1.2.7 重复性试验 称取橘皮样品，按上述方法制备供试溶液，平行测定5次，每次进样5 μL，测定橙皮苷的峰面积，计算RSD以考察方法的重复性。

1.2.8 稳定性试验 称取橘皮样品，按上述方法制备供试溶液，分别于0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h进样，检测橙皮苷的峰面积，以考察分析方法的稳定性。

1.2.9 回收率试验 采用加样回收试验，称取已测定橙皮苷含量分别为332.2、50.8、581.3、641.7 mg/kg的橘皮、橘肉、橘络、橘子试样各0.50 g，分别加入1.0 mL橙皮苷含量为100.0 μg/mL的标准品母液，按上述方法平行制备样品3份，分别测定其含量，进行回收率试验。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

对橙皮苷进行光谱扫描，结果如图1所示，橙皮苷最大紫外吸收波长为283.6 nm，查阅参考文献[16-18]，本试验采用283 nm作为检测波长。

2.2 标准工作曲线的建立

橙皮苷标准品色谱图见图2。以橙皮苷的色谱峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为：y=31 620.25x-21 235.4，R2=0.999 3，表明橙皮苷在2.0～10.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3 精密度试验结果

按“1.2.6”方法，测得橙皮苷的峰面积分别为580.1、575.2、585.1、590.9、586.6，计算其RSD为1.04%，结果表明该方法精密度良好。

2.4 重复性试验结果

按“1.2.7”方法，测得橙皮苷的峰面积分别为580.8、570.4、584.8、605.3、560.2，计算其RSD为2.81%，表明该方法的重复性良好。

2.5 稳定性试验结果

按“1.2.8”方法，测得0.5、1.0、6.0、12.0、24.0 h橙皮苷的峰面积分别为575.1、590.8、588.3、565.1、577.6，计算其RSD为1.80%，结果表明该方法的稳定性良好。

2.6 样品溶液的分析结果

分别取5.0 μL按“1.2.5”方法制备样品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后上机检测，色谱图见图3，与标准品色谱图（图2）比较，保留时间一致。

2.7 回收率测定结果

按“1.2.9”回收率试验方法测定并计算橙皮苷的加样回收率，结果见表1，橙皮苷平均回收率为95%～102%，RSD小于5.0%，表明该分析方法的准确度满足分析要求，结果可信。

2.8 柑橘中橙皮苷的含量测定

按照样品溶液制备方法，平行制备样品溶液3份，测定橘皮、橘肉、橘络、橘子中的橙皮苷的含量，结果见表2，柑橘不同组织中橙皮苷含量差异显著，橘子、橘络中橙皮苷含量高，橘肉中橙皮苷含量低，橘皮中橙皮苷含量较高，可作为提取橙皮苷的原料。

3 小结与讨论

3.1 橙皮苷的定性分析

在试验中同时分别采用了柚皮苷、新橙皮苷作为标准物质对柑橘提取物进行比对定性，从图4混合标准品色谱图中，柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的出峰时间分别为3.50、3.59、3.71 min。而所有柑橘组织的制备样品（图3）出峰时间为3.37 min和3.59 min，3.59 min峰为橙皮苷峰，3.37 min峰暂时不能确定其成分，柚皮苷和新橙皮苷在该试验中未检出。

与相关研究工作[19-21]比较发现，在色谱分析过程中均有柚皮苷标准品和样品色谱峰保留时间存在差异，其将样品中的物质定性为柚皮苷值得商榷，实际情况尚需进一步确定。

3.2 UPLC分析条件的选择

在该分析条件下，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷能完全分离，分离度大于1.5，分离效果好；色谱峰型好；运用UPLC对柑橘提取物进行分析，流速为0.3 mL/min，试剂消耗量小；流动相采用乙腈和水就能达到较好的分离效果，避免使用缓冲溶液，有效提高仪器的使用寿命；6.0 min就能完成一次全分析，较HPLC分析缩短一半的分析时间，分析效率高。UPLC的高分析效率、高分离度、低溶剂消耗在色谱分析中优势显著。

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