快速培养法应用与荧光定量PCR检测肺炎支原体

杨葵 兰俊

【摘 要】目的：探讨肺炎支原体快速培养法及荧光定量PCR在支原体感染早期快速诊断中的价值。方法：对我院呼吸内科及儿科216例疑似肺炎支原体感染的初诊患者同时进行肺炎支原体快速培养法和荧光定量PCR检测，并结合临床诊断及咽拭子真菌培养结果分析两种方法的临床应用价值。结果：216例患者咽拭子肺炎支原体快速培养阳性率为17.2%，荧光定量PCR法检出肺炎支原体阳性率为15.3%，两种方法检测肺炎支原体感染率无明显差异（P >0.05） ；儿童与成人肺炎支原体感染率无明显差异（P >0.05）。结论：荧光定量PCR方法特异性强，敏感性高，早期诊断意义较大， 但是需要贵重仪器设备且操作复杂，其缺点不太适合一般实验室广泛推广。快速培养法具有方便、简单、准确，且可以用于早期检测等优点，尤其适用于不易静脉血抽的新生儿和危重病人，但要排除真菌引起的假阳性，同时临床需提高对成人肺炎支原体感染的重视。

【关键词】肺炎支原体；快速培养法；荧光定量PCR

肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia， M P）是介于细菌与病毒之间的一种病原体微生物。在已发现的8种类型对动物致病的支原体中，只有肺炎支原体肯定对人致病。MP是儿童及成人呼吸道感染的主要病原体之一，是社区获得性肺炎的重要病原[1]。MP主要引起呼吸系统疾病，由口、鼻分泌物经空气传播，常为散发，也有小流行，自20世纪90年代以来，MP感染有逐年增多的趋势。据文献报道中国MP感染率在流行高峰期可达33%～35%[2]，国外可高达50%。主要见于儿童和青少年，也可见于成人，秋冬季较多。除直接导致呼吸道感染（咽炎、支气管炎及肺炎）外，MP尚可通过血行播散或免疫途径引起脑炎、肾炎及心肌炎等多种肺外并发症，严重威胁患者身体健康。因此，儿童及成人呼吸道感染时检测MP，对临床诊断和治疗均具有非常重要的意义。本研究对2011年12月至2012年12月泸州医学院附属医院就诊患者同时进行快速培养法及荧光定量PCR法检测，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集我院2011年12月至2012年12月期间住院部就诊患者的咽拭子标本，其中男119例，

女97例，儿童113例，成人103例。

1.2 试剂与仪器 肺炎支原体快速鉴定培养基由郑州安图绿科生物工程有限公司提供；PCR试剂由达安基因有限公司提供，PCR仪器为ABI7500fast荧光定量PCR仪。

1.3 方法 用无菌生理盐水浸过的棉拭子直接擦拭咽后壁，每位患者采集三个咽拭子标本。一份咽拭子作肺炎支原体快速培养：用加样枪取100ul无菌培养基液加入阴性对照孔，将采集到的咽拭子标本置于培养基瓶内搅动数次，取出已挤尽液体的棉拭子弃之，再用加样枪取该培养液100ul分别加于每孔（阳性孔和药敏孔），并每孔滴加液体石蜡一滴后盖上盖，置于37℃恒温箱中培养24-48h观察结果，培养液由桔红色变成黄色为阳性，培养液保持桔红色不变为阴性。一份咽拭子用于PCR检测，检测时严格按说明书操作。另一份标本做咽拭子真菌培养。快速培养和PCR结果出来后立即与临床诊断进行比较。

1.4 统计分析 用SPSS10.0软件进行统计分析，计数资料以百分比表示，用卡方检验，比较用t检验，P>0.05为无显著性差异。

2结果

2.1 216例疑似MP感染患者，咽拭子肺炎支原体快速培养阳性37例（阳性率17.2%），荧光定量PCR技术阳性33例（阳性率15.3%），如以PCR法为“金标准”，快速培养方法的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）分别为86.5%（32/37）、99.4%（178/179）、97.0%（32/33）、97.3%（178/183）。两种方法检测肺炎支原体感染阳性率比较无显著性差异（P>0.05），见表1。

216例患者中被确诊为MP感染者41例，快速培养法与荧光定量PCR法的临床符合率分别为94.6%和93.9%。

2.2 在113例儿童中被确诊为MP感染22例（阳性率19.5%），103例成人中被确诊为MP感染19例（18.4%）。两个年龄阶段MP感染阳性率无显著性差异（P>0.05），见表2。

3讨论

肺炎支原体是造成呼吸道感染的主要病原体，目前检测MP的主要诊断方法包括分离培养、血清学和分子生物学方法。分离培养法是MP鉴定的金标准，MP快速培养法操作简便价格低廉，对实验室条件要求不高，且咽拭子采集标本无创伤性，为MP感染的早期诊断提供了一个有效的方法。MP抗体检测法是常用的血清学方法，其最佳检测时间为临床症状出现后7～10 d（窗口期），抗体10 ～30 d达高峰，12～16周又转阴，故12周后血清MP-IgM多为阴性[3]。虽然MP-IgM抗体特异性高，但一些免疫缺陷或免疫系统尚未发育完善的患儿不能对病原体产生正常的免疫应答，在MP感染的情况下也不能产生MP-IgM抗体；其次，MP感染后，高滴度抗体可在感染后保持数月，从而难以区别现症感染与既往感染。国内外针对MP的分子生物学方法主要以聚合酶链反应即PCR为主。PCR方法特异性强，敏感性高，早期诊断意义较大，但由于受实验条件及设备的限制，不易普及开展。

本实验肺炎支原体快速鉴定培养基为一种人工合成液体培养介质，其组成材料是根据肺炎支原体结构繁殖增生下所需要营养成分而合理配置的一套蛋白质、磷脂、碳水化合物、胆固醇、微量元素及复合抑菌因子等混合而成的营养丰富、特异性强的专用培养基，其机理是快速繁殖增长的肺炎支原体分解葡萄糖产酸使培养基PH降低，产生颜色变化来判断肺炎支原体生长，标本中其他细菌因培养基中加入了青霉素、醋酸铊和生物抑菌剂等被抑制[4]。而荧光定量PCR方法是近年来兴起的检测肺炎支原体的新方法。据报道[5]，实时荧光定量PCR的假阳性非常少见。我们运用了达安基因有限公司提供的荧光定量试剂盒对肺炎支原体DNA进行检测，取得满意效果，这一方法准确可靠。但是需要贵重仪器设备且操作复杂，其缺点不太适合一般实验室广泛推广。

MP肺炎主要的临床表现是：起病可急可缓，可有发热，热型不定。开始咳嗽为干咳，后转为顽固性剧烈咳嗽，有时表现百日咳样咳嗽，也有少数患儿表现为偶咳甚至不咳。MP肺炎X线（住院DR）表现可各不相同，按其侵润范围主要有以下三种：①以间质为主的表现为肺纹理增粗、模糊，网点状阴影，同时伴有肺纹模糊，结构紊乱。②小叶性肺炎的表现，为斑片状阴影和云絮状密度增高影。③肺段实质侵润，表现为累及1-2个肺段的大片状致密影，呈三角形或扇形，边缘清晰，自肺门向肺野分布的大片状阴影密度较淡，边缘模糊，内可见肺纹理[6]。若患者有上述临床表现和X线表现，临床医生可明确诊断MP感染。本研究中，216例患者中被确诊为MP感染者41例，快速培养法与荧光定量PCR法的临床符合率分别为94.6%和93.9%。

从表1结果显示：快速培养法肺炎支原体的阳性率（17.2%）与荧光定量PCR法的肺炎支原体阳性率（15.3%）相比，无显著差异性（P>0.05）。研究显示：肺炎支原体快速培养法与荧光定量PCR法结果一致性较好，符合文献报道[7-9]。已有研究发现[10]快速培养法具有操作简便、快速、敏感等优点，对临床诊断治疗有非常好的指导作用.无需特殊设备与仪器。本研究如以荧光定量PCR法为“金标准”，快速培养方法的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）分别为86.5%（32/37）、99.4%（178/179）、97.0%（32/33）、97.3%（178/183），表明快速培养法的敏感性和特异性较高，适合各级医院MP的早期诊断，且快速培养法具有方便、简单、准确，且可以用于早期检测等优点，尤其适用于不易抽静脉血的新生儿和危重病人。

从表2结果显示：儿童与中老年肺炎支原体感染阳性率无明显差异。MP感染主要见于儿童和青少年，通过本研究显示成人肺炎支原体感染率在本地区相对有所上升，不可忽视。因此对于国内许多报道的肺炎支原体感染以儿童为主并不全面，忽略了成人肺炎支原体感染.从而导致肺炎支原体感染后不能及时对症治疗致使肺炎支原体感染后引起心肌炎、肾炎等肺外疾病临床频频发生。为此临床科室应将肺炎支原体感染的成人与感染肺炎支原体的儿童给予相同重视，及早诊断与治疗，以预防肺炎支原体肺外感染疾病。

有1例快速培养法阳性的患者，其血平板培养发现真菌，文献报道快速培养时真菌污染会导致假阳性的结果[11-12]，该患者反复发热，伴咳嗽，住院DR示双肺间质性改变、双肺多发感染灶，被临床确诊为MP感染，这说明了该例患者为MP和真菌的混合感染。为了排除真菌引起的MP快速培养假阳性，我们在做MP快速培养的同时，应该要做咽拭子真菌培养，并与临床相结合，避免因真菌引起的假阳性所造成的误诊，为临床医生提高诊断肺炎支原体肺炎诊治率提供可靠的检验依据。

综上所述，快速培养法和荧光定量PCR法检测MP感染率无明显差异，荧光定量PCR方法特异性强，敏感性高，早期诊断意义较大， 但是需要贵重仪器设备且操作复杂，其缺点不太适合一般实验室广泛推广。快速培养法具有方便、简单、准确，且可以用于早期检测等优点，尤其适用于不易抽静脉血的新生儿和危重病人，但要排除真菌引起的假阳性，同时临床需提高对成人肺炎支原体感染的重视。

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