肿瘤坏死因子— α拮抗剂对椎间盘基质代谢的影响

陶奇昌 陆军 李强

【摘 要】目的：建立兔椎间盘退行性变动物模型，探讨肿瘤坏死因子-α拮抗剂（TNF-α Ra）对存在退行性变的兔椎间盘基质代谢的影响。方法：建立兔椎间盘退行性变动物模型，随机分为试验组和对照组，每组9只，试验组从造模2周腹腔注射TNF-α拮抗剂（417 ug/kg），隔4天重复注射至处死，对照组9只不予任何处理。于造模后1、2、3个月每组分别处死3只大白兔，完整取出腰3/4椎间盘固定、切片，予SABC法进行免疫组化，并使用图像分析系统对纤维环中Ⅱ型胶原染色进行灰度值扫描，同理取出腰5/6椎间盘，使用间苯三酚法测量蛋白多糖含量。结果：术后第一个月试验组与对照组椎间盘髓核中Ⅱ型胶原灰度值及蛋白多糖含量无显著性差异（P>0.05），第二个月及第三个月试验组与对照组Ⅱ型胶原染色的灰度值及蛋白多糖含量相比有非常显著性差异（P<0.01）。结论：TNF-α拮抗剂对存在退行性变的兔椎间盘基质代谢有明显的抑制作用。

【关键词】椎间盘；退行性变；免疫组化；间苯三酚；肿瘤坏死因子-α拮抗剂

椎间盘的退行性变是引发下腰痛的主要原因之一[1]。目前治疗方案主要是对于有明显症状、椎间盘退行性变晚期的患者行手术治疗[2] 。TNF-α是重要的炎性细胞因子之一，有研究表明软骨细胞能产生这种细胞因子，并能促进软骨细胞产生前列腺素E2（PGE2）和胶原酶参与退行性骨关节病的发病[3，4]。本研究使用TNF-α拮抗剂对存在早期退变的兔椎间盘进行干预，观察TNF-α拮抗剂对兔腰椎间盘胶原代谢的影响及蛋白多糖的变化，并观察其组织学的变化。

1 材料与方法

1.1 材料 健康4月龄雄性新西兰大白兔18只，由东南大学医学院试验动物中心提供；注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白（益赛普），购自上海中信国健药业有限公司；免疫组化染色试剂盒、兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；SABC试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；间苯三酚购自南京恒生制药有限公司；日本OLYMPUS光学显微镜。

1.2 方法

1.2.1 实验动物模型的建立及分组 椎间盘退变模型的建立参考如下方法[5]：实验动物术前12h禁食， 3%戊巴比妥钠溶液（1mL/kg）耳缘静脉注射麻醉，右侧卧位，透视定位腰3/4平面[ 6]，将腹内脏器侧移，透视针尖位于椎间隙平面，进行穿刺。穿刺部位消毒包扎，于耳缘静脉滴注青霉素40×104U。动物苏醒后放回兔笼，肌注青霉素40×104U，1次/天，连续注射3天。随机取9只大白兔做试验组，隔4天腹腔注射益赛普（417ug/kg体重），分别于术后1月、2月、3月时各处死3只大白兔，动物处死后立即取出腰椎，立即用蒸馏水冲洗三遍后置入10%中性福尔马林缓冲液中固定24h，常规EDTA脱钙、石蜡包埋，沿椎间盘正中水平面向上下按5μm厚度连续切片共10张，其中5张玻片留作Ⅱ型胶原免疫组化（髓核），另一侧5张留作其他试验使用。对照组共9只不予任何处理。试验过程中标本处理及检测等各实验步骤均严格保持一致。按上述方法取腰5/6椎间盘置入超低温冰箱中集中检测蛋白多糖。

1.2.2 免疫组化法 常规制备石蜡切片，蒸馏水与30%双氧水按体积10：1混合，室温下滴入组织，等待10min。蒸馏水冲洗3次，复合修复液修复10min，水洗3次，滴加5%牛血清白蛋白 室温封闭20min，滴加浓度为2% 兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体，4℃过夜。磷酸盐缓冲液冲洗，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG37℃放置20min，滴加链霉亲和素-生物素复合物试剂置于37℃ 20min，DAB显色，以肉眼观察组织显色，当组织显色为咖啡色时即自来水冲洗。.以苏木素复染，脱水、透明、封片。阳性部位都是细

胞外基质。每批试验都随机抽1张做为阴性对照，即将1抗换成磷酸盐缓冲液 ，其余步骤同前。切片使用Simple PCI图象分析软件对髓核中Ⅱ型胶原的含量进行分析。将灰度值阈值调成0-255，灰度值越高，则表明胶原的含量越低，测得灰度值作为胶原的相对含量。

1.2.3 蛋白多糖测定 取出椎间盘组织置于离心管中，加入3%NaOH0.5ml置入恒温振荡器中振荡3h，保持温度在40℃。加入盐酸约2ml，把溶液pH值调至8～9，加入100mg/ml胰蛋白酶50μl酶解2h。.将溶液以间苯三酚法[7]测定蛋白多糖的含量，结果以mg/100mg湿重表示。

1.3 统计学处理 实验数据采用统计软件 SPSS 12.0，所有数据均采用 s表示，各组间比较运用t检验分析进行统计。

2 结果

2.1 免疫组化 试验发现第一个月试验组与对照组髓核中Ⅱ型胶原免疫组化染色灰度值相似，随着试验时间增加，试验组较对照组髓核中Ⅱ型胶原免疫组化染色灰度值低，具体各组大白兔Ⅱ型胶原免疫组化染色的灰度值见表1。

2.2 蛋白多糖测定结果 第一个月时试验组与对照组蛋白多糖含量相近，无统计学差异。随着试验时间增加，对照组大白兔椎间盘蛋白多糖的含量明显下降，第二月及第三月时试验组与对照组相比P<0.01。具体数据见表2。

3 讨论

椎間盘中的蛋白多糖是由核心蛋白与数目不等的糖胺多糖（glycosaminog lycan， GAG）链通过共价键连接而形成的生物大分子。蛋白多糖的代表蛋白聚糖（aggrecan）被进行广泛深入的研究。蛋白聚糖中的糖胺多糖主要是硫酸软骨素（CS）、透明质酸（HA）和硫酸角质素（KS）。GAG含量的改变能可靠的反映PG的变化[8]。在椎间盘退变的早期，蛋白多糖就可出现改变，而且其可以反映椎间盘退变的程度[9]。退变椎间盘中蛋白多糖含量下降同时其性质发生改变，伴随基质中水分的丢失，导致椎间盘基质的固定电荷密度和水合状态改变，从而引起椎间盘生物力学的改变，加剧椎间盘退变。

Takahashi N等研究发现，突出的椎间盘细胞可合成和分泌TNF-α、白介素-1（IL-1）、PGE2等多种炎性介质[10]。肿瘤坏死因子可以诱导炎症因子如IL-1的产生，，而大量试验表明IL-1可以通过一氧化氮（NO）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等多种途径参与降解椎间盘基质，从而加速椎间盘退变。注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白是人Ⅱ型肿瘤坏死因子（TNF）受体p75的膜外区与IgG的Fc段构建的融合蛋白，可特异性的阻断TNF-α与其细胞表面受体的相互作用，从而 抑制IL-1对基质中胶原的降解，延缓甚至阻止椎间盘的退变。

国内外已有报道将TNF-α拮抗剂应用于动物及人体，但将其应用于椎间盘退行性变动物模型尚未见报道。本试验结果显示在第一个月试验组大白兔椎间盘髓核中Ⅱ型胶原染色的灰度值及髓核中蛋白多糖含量无明显变化，可能原因为干预过早[5]，椎间盘尚未发生明显退变有关。第二个月及第三个月时试验组及对照组髓核中Ⅱ型胶原灰度值及蛋白多糖的含量有非常显著统计学意义（P<0.01），提示TNF-α拮抗剂能较强的抑制椎间盘胶原及蛋白多糖的降解，对椎间盘的退变有较强的保护作用。

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