桥本甲状腺炎患者外周血单个核细胞程序性死亡因子5的表达及其意义

赵 杰，赵丽娜，赵 静，张秀军

桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis，HT)是一种器官特异性自身免疫性疾病，以对甲状腺抗原的免疫应答和甲状腺腺体内的淋巴细胞浸润为特征，其发病机制涉及细胞免疫和体液免疫的异常。近年来人们逐渐认识到细胞凋亡在HT的发病机制中起着重要的作用。程序性死亡因子5(programmed cell death 5，PDCD5)是一种重要的凋亡调控分子，研究发现PDCD5在凋亡相关疾病如恶性肿瘤及自身免疫性疾病的发病过程中起重要的作用。有研究证实，HT患者甲状腺细胞中PDCD5呈阳性表达[1]。本研究采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定了60例HT患者外周血单个核细胞(peripheral blood monouclear cell，PBMC)PDCD5 mRNA的表达情况，探讨PDCD5与HT发生发展的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料选取华北煤炭医学院附属医院2006年3—8月内分泌门诊或住院HT患者60例(HT组)，其中男8例，女52例；平均年龄(40.2±14.5)岁。根据临床表现、甲状腺功能检测结果、甲状腺核素扫描结果等临床诊断为HT。所选患者均为尚未给予治疗的初诊患者，且无其他自身免疫性疾病、肿瘤及其他内分泌疾病史。根据患者外周血血清中抗甲状腺微粒体抗体(TMAb)水平，将其分为HT1 组(TMAb≤45%)36例和HT2组(TMAb>45%)24例。另选取同期在我院体检的健康者40例(对照组)，其中男5例，女35例；平均年龄(38.1±11.3)岁；均与HT组患者的性别构成、年龄匹配。

1.2主要试剂淋巴细胞分离液(中国医学科学院血液学研究所)；总RNA提取试剂Trizol(北京天为时代科技有限公司)；莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶逆转录试剂盒(Promega Corporation)；2×Taq PCR MasterMix(北京天为时代科技有限公司)；dNTP、Ribonuclease Inhibitor、DL2000(宝生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1淋巴细胞的分离取HT组和对照组肝素抗凝外周血5 ml，按常规Ficoll密度梯度离心分离PBMC。

1.3.2半定量RT-PCR方法检测PDCD5基因的表达

1.3.2.1总RNA提取细胞总RNA的提取按Trizol RNA总提取试剂盒说明书进行。反应结束后，取适量的RNA进行紫外线定量(OD260/OD280)和1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定其完整性，余者在-70 ℃保存。

1.3.2.2cDNA合成以获得的细胞总RNA为模板，使用MML-V逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，采用25 μl反应体系。逆转录条件：37 ℃水浴1 h，72 ℃水浴10 min，-20 ℃保存。

1.3.2.3引物设计与合成利用Primer Premier 5.0设计PDCD5基因引物序列，上游引物：5′-CAA CAG GAA GCA AAG CAC-3′，下游引物：5′-GAT CTT AAC TTC TGT CCT AGA C-3′，PCR扩增片段长度384 bp。内参照β-actin引物序列，下游引物：5′-CCC AGG CAC CAG GGC GTG ATG GT-3′，上游引物：5′-GGA CTC CAT GCC CAG GAA GGA A-3′，PCR扩增片段长度701 bp。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化。

1.3.2.4PCR扩增取2 μl cDNA，分别加入10 pmol特异性PDCD5(或β-actin)上游和下游引物，12.5 μl 2×Taq PCR Master Mix和8.5 μl 双蒸水，反应体系为25 μl。经优化的PCR反应条件为：预变性94 ℃ 3 min，然后94 ℃变性40 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min结束反应。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，BIO-RAD-GD2000凝胶成像系统照相记录试验结果，Quantity one软件分析条带灰度值。384 bp和701 bp均有条带显示时记作PDCD5 mRNA表达阳性，计算PDCD5与β-actin RT-PCR产物吸光度比值(RI值)，将RI值作为PDCD5 mRNA的相对含量。比较对照组和HT组PBMC PDCD5 mRNA表达阳性率及其相对含量。然后比较HT1组和HT2组患者甲状腺功能〔总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)〕、血清甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平及PBMC PDCD5 mRNA表达水平。

2　结果

2.1序列测定PDCD5基因PCR扩增产物进行双向序列测定，经与Gene Bank对比，同源性均为100%，证实PCR产物的正确性。

2.2对照组和HT组PBMC PDCD5基因的表达对照组中，24例(60.0%)健康者PBMC PDCD5 mRNA表达阳性，相对表达水平为(0.38±0.08)。HT组中，52例(86.7%)患者PBMC PDCD5 mRNA表达阳性，相对表达水平为(0.87±0.19)。HT组患者PDCD5 mRNA表达阳性率、相对表达水平与对照组比较，差异均有统计学意义(χ2=9.355，P<0.01；t=4.870，P<0.01，见图1)。

2.3HT1组和HT2组患者甲状腺功能、血清TGAb水平及PDCD5 mRNA表达水平比较两组患者血清TT3、TT4、FT3、FT4水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；而两组患者甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平及PBMC PDCD5 mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.01，见表1、图1)。

3　讨论

PDCD5基因是由北京大学人类疾病基因研究中心从人的白血病细胞株TF-1中克隆得到的新基因，该基因定位于染色体19q12-q13.1，由6个外显子和5个内含子组成，在人类50余种组织中均有表达。PDCD5具有促进多种细胞凋亡和抑制增殖的效应，不仅在细胞凋亡时表达增加，而且凋亡早期就出现明显的核转位现象[2]。该因子可与Caspase-3特异性结合，提高Caspase-3蛋白的活性[3]。单独存在时不具备诱导凋亡的作用，但与其他凋亡诱导剂同时存在时则可明显促进凋亡进程。

HT是一种常见的自身免疫性甲状腺病(AITD)，免疫损伤主要累及甲状腺，最终导致甲状腺滤泡破坏和甲状腺功能减退症，其发病机制尚未完全清楚。最近的研究发现甲状腺细胞凋亡的调控异常是导致HT发病的主要原因之一[ 4-6]。HT甲状腺细胞表达Fas/ FasL[7]，且其表达量与甲状腺细胞和浸润淋巴细胞之间的距离呈反比[8]，提示Fas/FasL凋亡通路在HT发病中起重要作用。Hammond等[9]采用流式细胞术检测了1例正常者、4例HT患者、8例Graves病(GD)患者甲状腺细胞Fas的表达，结果显示GD患者和HT患者甲状腺细胞凋亡率明显高于正常者，其中尤以HT患者甲状腺细胞凋亡率最高。

注： 1、2为HT1组，3、4、9、10为HT2组，5、6、7、8为对照组，M为DNA marker

图1半定量RT-PCR方法检测 PDCD5 mRNA表达水平的电泳图

Figure1PDCD5 mRNA expression in PBMC of patients with HT by RT-PCR

表1　HT1组和HT2组患者甲状腺功能、TGAb水平及PDCD5 mRNA表达水平比较

注： TT3=总三碘甲状腺原氨酸，TT4=总甲状腺素,FT3=游离三碘甲状腺原氨酸，FT4=游离甲状腺素，TGAb=甲状腺球蛋白抗体，PDCD5=程序性死亡因子5

细胞凋亡在维持组织的自身平衡、控制异常细胞的生长以及调节免疫反应中起重要作用，是限制外周循环中自身反应性T细胞过度增殖的重要方式。破坏细胞凋亡平衡将会引起自身免疫的紊乱，引发自身免疫性疾病。HT外周血淋巴细胞凋亡的机制复杂，涉及多种凋亡相关因子，因此报道较少。Maruoka等[10]认为，病情严重的自身免疫性甲状腺病患者外周T淋巴细胞Fas表达增高。已报道PDCD5在正常甲状腺滤泡细胞中几乎未见表达，在HT甲状腺滤泡细胞中呈阳性表达，PDCD5参与了HT的发病过程[1]。本研究结果显示，HT患者和健康者PBMC PDCD5 mRNA表达的阳性率分别为86.7%和60.0%，提示PDCD5在健康者和HT患者的PBMC中普遍表达，PDCD5可能是对PBMC(以淋巴细胞为主)的凋亡有重要作用的管家基因。另外，本研究中HT患者PDCD5 mRNA表达阳性率和相对表达水平均高于健康者，提示PDCD5可能是继Fas、Bcl-2、TRAIL[8]等经典凋亡途径之后又一新的影响HT免疫细胞凋亡平衡的因子。

HT可产生多种自身抗体并且发生一系列反映甲状腺功能的血清激素水平的改变。HT的发病是一个慢性过程，发病初期比较隐匿，早期表现为类似于甲状腺功能亢进的症状，表现为TT3、TT4水平升高，促甲状腺激素(TSH)水平降低，后期随着病情的发展才表现为甲状腺功能减退症状。HT时TMAb、TGAb升高，TMAb、TGAb是反映HT病情和病情进展情况的最主要的指标。本研究进一步根据血清TMAb水平，将HT患者分为HT1组和HT2组，发现HT2组患者TGAb水平及PDCD5 mRNA表达水平高于HT1组。提示随着血清TMAb水平的升高，HT患者血清TGAb水平和PBMC PDCD5 mRNA的相对表达水平都相应升高。本研究选择未经治疗的初诊HT患者，随病情加重PDCD5表达增加，与其甲状腺上皮细胞损伤的病理特征相符，推测细胞凋亡可能是导致其甲状腺功能减退的原因之一。PBMC PDCD5 mRNA的表达水平能够在一定程度上反映HT的病情进展情况。

综上所述，HT患者PBMC PDCD5 mRNA的表达上调，而且随着病情的加重PDCD5的表达增加，提示PDCD5可能作为淋巴细胞凋亡的正调控因子在HT的发生和发展过程中具有重要意义。但是疾病发生过程是多种凋亡调控基因共同作用的结果，关于PDCD5如何影响HT凋亡平衡的具体机制还有待于进一步研究。

1王海宁，杜颖，洪天配.TF-1细胞凋亡相关基因19在桥本病甲状腺细胞中的表达[J].中华内分泌代谢杂志，2004，20(2)：119-120.

2Chen YY，Sun RH，Han WL，et al.Nuclear translocation of TFAR19(PDCD5)：an early signal for apoptosis[J].FEBS letter，2001，509(27)：191-196.

3Liu H，Wang Y，Zhang Y，et al.TFAR19，a novel apoptosis-related gene cloned from human leukemia cell line TF-1，could enhance apoptosis of some tumor cells induced of growth factor withdrawal [J].Biochem Biophys Res Commun，1999，254(1)：203-210.

4Andrikoula M，Vatholomatos G，Tsangaris GT，et al.Fas and Bcl-2 protein expression in thyrocytes of patient with nodular goiter[J].European Journal of Endocrinology，2001，145(4)：403-407.

5Salmaso C，Bagnasco M.Regulation of apoptosis in endocrine autoimmunity：insights from Hashimoto′s thyroiditis and Graves′ disease[J].Ann N Y Acad Sci，2002，966(6)：496-501.

6Chen S，Fazle Akbar SM.Analysis of the expression of Fas，Fast and Bcl-2 in the pathogenesis of autoimmune thyroid disorders[J].Cell Mol Immunol，2004，1(3)：224-228.

7刘建夏，秦磊，左剑玲，等.Fas/FasL介导的凋亡在桥本病发病机制中的作用[J].中华内分泌代谢杂志，2003，19(2) ：107-108.

8Stokes TA，Rymaszeuski M，Arscott PL，et al.Constitutive expression of FasL in thyrocytes[J].Science，1998，279(5359)：2015.

9Hammond LJ，Lowdell MW，Cerrano PG，et al.Analysis of apoptosis in relation to tissue destruction associated with Hashimoto′s autoimmune thyroiditis[J].J Pathol，1997，182(2)：138-144.

10Maruoka H，Watanaba M，Matsuzuka F，et al.Increased intensities of fas expression on peripheral T-cell subsets in severe autoimmune thyroid disease[J].Thyroid，2004，14(6)：417-423.