谷氨酰胺对慢性阻塞性肺疾病患者外周血单个核细胞中核因子-κB及IL-6的影响

居建刚 黄美健 周凌燕 汤晓燕 冷报浪 任娥

谷氨酰胺对慢性阻塞性肺疾病患者外周血单个核细胞中核因子-κB及IL-6的影响

居建刚 黄美健 周凌燕 汤晓燕 冷报浪 任娥

目的 通过观察谷氨酰胺（Gln）对慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者外周血单个核细胞（PBMC）中NF-κB活性和IL-6水平的影响，探讨Gln在COPD患者治疗中的抗炎作用。 方法 收集30例COPD患者在COPD急性加重期（AECOPD）和COPD稳定期（SCOPD）的外周血PBMC各30例，各分为Gln组细胞培养时加入浓度为8 mmol/L的Gln和空白对照组，并以15例健康体检者作为对照组。采用RT-PCR法测定5组外周血PBMC中NF-κBp65、IL-6基因的表达。 结果 健康对照组NF-κBp65、IL-6表达水平低于AECOPD空白对照组（均P＜0.01），与SCOPD空白对照组比较（均P＜0.05）。AECOPD Gln组与健康对照组NF-κBp65、IL-6比较有统计学意义（均P＜0.05），而SCOPD Gln组NF-κBp65、IL-6与健康对照组比较无明显差异（均P＞0.05）。AECOPD Gln组与空白对照组比较NF-κBp65、IL-6的表达明显降低（均P＜0.05）。SCOPD空白对照组NF-κBp65、IL-6与Gln组比较表达有统计学意义（均P＜0.05）。结论 Gln可抑制COPD患者炎性转录因子NF-κB活性，并下调IL-6的表达水平。

慢性阻塞性肺疾病 谷氨酰胺 单个核细胞 核因子-κB 白介素-6

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是呼吸系统疾病中的常见病和多发病，患病率及死亡率均高，已经成为社会的主要疾病负担之一。COPD作为一种慢性病，其确切的发病机制尚未完全明了，目前普遍认为COPD以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征[1]，而在炎症的发生、发展过程中炎症细胞的激活和转录起到非常重要的作用。因此如何对COPD患者炎症进行抑制是当前众多学者研究的热点，本研究采用RT-PCR法，观察谷氨酰胺（Gln）对COPD急性加重期（AECOPD）和COPD稳定期（SCOPD）患者外周血单个核细胞（PBMC）中NF-κBp65、IL-6基因表达水平的影响，探讨Gln在COPD治疗中的抗炎作用。

1 对象和方法

1.1 对象 从2011年5月至2012年4月在本院呼吸内科住院的AECOPD患者中筛选出30例，其中男18例，女12例，年龄54～75岁，平均（70.1±4.7）岁；均符合2007年COPD诊治指南修订版[2]（轻度5例，中度18例，重度7例）；并排除心脑血管系统疾病和呼吸系统中的其他疾病、较严重的消化系统疾病、肾病、糖尿病等内分泌代谢疾病、肿瘤以及重大手术和结缔组织病等；SCOPD为上述30例患者经抗感染、祛痰以及扩张支气管等药物治疗10～20d临床症状好转，病情稳定进入缓解期；健康对照组为健康体检者15例，男9例，女6例，年龄52～76岁，平均（68.4±6.9）岁；经询问病史及 X线检查未患过重大疾病且在近1个月内未患过呼吸系统疾病。所有纳入研究的患者均签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准同意。COPD患者和健康对照组比较，性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验试剂及器材 人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物公司)；无GInRPMI 1640细胞培养液（GIBCO公司）；L-Gln（中国医学科学院）；Trizol（上海生物工程有限公司）；反转录试剂盒定、定量试剂盒、DL2000 DNA Marker（宝生物工程（大连）有限公司）;ABI7500定量PCR仪（美国Pharmacia公司）。

1.2.2 PBMC的提取 清晨抽取研究对象静脉血5ml，置于肝素抗凝管中，立即进行分离。用磷酸盐缓冲液（PBS）将人血稀释至2倍。室温下，将4ml淋巴细胞分离液加入15ml离心管，再将10ml人血稀释液加入离心管，使其覆盖于淋巴细胞分离液上。室温下以1 500 r/ min离心15min，毛细吸管吸取中层PBMC，得到的PBMC以5倍体积PBS液洗涤、1 000r/min离心10 min，弃去上清液，底层为PBMC。

1.2.3 分组 提取的PBMC用无GlnRPMI1640培养液调节细胞浓度为2.0×106个/ml，健康对照组PBMC只用1640培养液培养。AECOPD患者平均分成两组：（1）Gln组：患者的PBMC中加入浓度为8 mmol/L的Gln；（2）空白对照组：仅用1640培养液培养。SCOPD患者平均分成两组：（1）Gln组：患者的PBMC中加入浓度为8 mmol/L的Gln；（2）空白对照组：仅用1640培养液培养。最后-80℃保存待测。

1.2.4 RT-PCR法检测核因子-κB（NF-κB）p65、IL-6基因的表达 引物设计采用Primer 5.0引物设计软件和引物设计原则进行荧光引物的设计，然后由上海生物工程有限公司负责合成:NF-κBp65引物序列：上游5'-GCGAGAGGAGCACAGATACC-3′，下游5′-CTGATAGCCTGCTCCAGGTC-3′；IL-6引物序列：上游5′-AGGAGACTTGCCTGGTGAAA-3′，下游5′-CAGGGGTGGTTATTGCATCT-3′；GAPDH引物序列：上游5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游5′-GAAGATG GTGATGGGATTTC-3′；扩增长度分别为250、180和226bp。用Trizol法提取总RNA，用反转录酶合成cDNA，均按试剂盒说明操作。PCR反应体系：2×SYBR 12.5μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板2μl，最后ddH2O补充体积至25μl。反应条件：94℃ 5min，94℃15s，60℃45s，循环扩增40次。60℃检测荧光值。实验样本经定量PCR得到Ct值后运用2-△△Ct法进行相对定量结果判读。首先确立对照组，设定目标基因在该对照组中表达水平为1，结果表达为实验组目的基因表达相对于对照组的变化倍数，其中△Ct=Ct目的基因-Ct管内对照基因；△Ct值越高，表达水平越低。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 目的基因及内参电泳图 根据Marker指示，扩增条带为目的条带，电泳图中无杂质，说明PCR扩增为特异性扩增（见图1）；实时荧光PCR扩增显示各个引物扩增产物熔点曲线图均具有单一主峰，表明引物荧光定量PCR扩增具有较强的特异性。

图1 目的基因及内参电泳图（1：IL-6；2：NF-κB p65；3：GAPDH；M：Marker）

2.2 各组PBMC中NF-κBp65、IL-6△Ct值变化比较 见表1。

由表1可见，健康对照组NF-κBp65、IL-6表达水平与AECOPD空白对照组比较均明显降低（均P＜0.01），与SCOPD空白对照组比较均有统计学差异（P＜0.05）。AECOPD Gln组与健康对照组NF-κBp65、IL-6比较均有统计学意义（均P＜0.05）。SCOPD Gln组NF-κBp65、IL-6与健康对照组比较均无明显差异（均P＞0.05）。AECOPD Gln组与空白对照组比较NF-κBp65、IL-6的表达明显降低（P＜0.05）。SCOPD空白对照组NF-κBp65、IL-6与Gln组比较表达有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 各组PBMC中NF-κBp65、IL-6△Ct值变化比较

3 讨论

COPD是一种可以预防和可以治疗的常见疾病,其特征是持续存在的气流受限。气流受限呈进行性发展,伴有气道和肺对有害颗粒或气体所致慢性炎症反应的增加[1]，急性加重和合并症影响患者整体疾病的严重程度。COPD发病机制主要有肺部炎症氧化/抗氧化失衡以及蛋白酶/抗蛋白酶的失衡,而众多研究表明肺部炎症反应在COPD发病机制中具有重要作用，因此研究对COPD患者炎症反应的抑制和干预，已受到越来越多的关注。

NF-κB常以p65/p50异源二聚体的形式存在。在各种因素刺激下，NF-κB迅速激活，p65亚基进入核内直接作用于转录元件而激活转录过程，调节多个基因的转录，在先天免疫、炎症反应、组织纤维化和细胞凋亡中起重要作用[3]。而IL-6是介导机体炎症反应的重要细胞因子，在炎症反应中起调节作用，是炎症免疫反应的重要递质。研究发现IL-6显著影响COPD的全身炎症反应，而呼吸困难、骨骼肌萎缩、胰岛素抵抗、肺动脉高压与其过度表达有关[4-5]。NF-κB有涉及并调节体内炎症的抗炎作用，其诱导和吸引炎性基因表达的作用在炎症相关性疾病的治疗中引起广泛关注[6]。研究发现COPD患者或COPD动物模型的肺组织内NF-κB活性显著增加，而受NF-κB调控的TNF-α、IL-6等细胞因子也明显上调[7]。可见NF-κB能从上游调控COPD炎症，是炎症调节的枢纽和关键，其激活是COPD患者急性加重的关键环节之一，抑制NF-κB活化可能会有效改善COPD的过程，这或许将成为治疗COPD的一种新方法。

Gln是人体中的一种条件性必需氨基酸，是免疫系统的主要能源，具有广泛的生物学活性，近年来有研究显示，Gln能下调脂多糖（LPS）刺激下的人体PBMC中多种炎症因子的过度表达[8]。Singleton等[9]对败血症小鼠治疗的研究发现Gln能抑制NF-κB激活及细胞因子的表达，其Gln治疗组显著降低肺中TNF-a和IL-6的表达。另有研究也证实Gln可减少促炎性细胞因子如TNF-a和IL-6的释放，提高脓毒症动物的生存率[10]。基于上述的研究和发现促使我们思考：能否从炎性反应的角度，通过应用Gln来抑制肺组织中NF-κB和IL-6等炎症因子的表达而实现其抗炎作用，起到改善COPD患者症状的作用。

本研究运用Gln干预AECOPD患者治疗前后外周血PBMC，并用Real-Time PCR法检测PBMC中NF-κBp65、IL-6表达变化，Real-time PCR扩增电泳图结果提示NF-κBp65、IL-6在COPD患者炎症细胞上存在表达。正常对照组较AECOPD治疗前后空白对照组表达量低，且急性加重期较稳定期高，证实了NF-κBp65、IL-6在COPD急性加重期和稳定期的长期存在，进一步证明了COPD为一种慢性炎症的实质。本研究结果还发现COPD急性加重期和稳定期中空白对照组较Gln组的NF-κBp65、IL-6表达显著升高，提示Gln可抑制COPD患者外周血PBMC中NF-κB活化，并减少炎症介质IL-6的释放。同时AECOPD Gln组与正常组比较有统计学意义，而SCOPD Gln组与正常组比较无统计学意义，这可能与急性期炎症细胞的表达较高，而稳定期炎症细胞较低及Gln的干预有关。目前国内关于Gln对COPD患者PBMC中NF-κB及IL-6表达的影响还尚未见报道。本研究采用COPD患者外周血中PBMC为研究对象，应用Gln干预COPD患者PBMC，观察细胞中NF-κB和IL-6表达水平的变化，进一步明确了两者参与COPD的炎症反应，为药物治疗COPD提供了新的理论依据。

通过体外实验，我们认为NF-κB、IL-6参与了COPD的炎性反应；Gln能明显抑制COPD患者外周血PBMC中NF-κB、IL-6表达，抑制炎性反应对COPD具有潜在的治疗价值，但其具体的机制仍有待进一步更深入的研究。

[1] GOLD.Global Strategy for the diagnosis,Management,and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease[OL]. 2011.www.goldcopd.org.

[2] 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.COPD诊治指南(2007年修订版)[J].中华结核和呼吸杂志,2007,30(1):8-17.

[3] Muriel P.NF-kappaB in liver diseases:a target for drug therapy[J].Journal of Applied Toxicology,2009,29(2):91-100.

[4] Bolton C E,Evans M,Ionescu A A,et al.Insulin resistance and inflammation:a further systemic complication of COPD [J].COPD,2007,4:121-126.

[5] Eddahibi S,Chaouat A,Tu L,et al.Interleukin-6 gene polymorphism conferssusceptibilityto pulmonaryhypertension in chronic obstructive pulmonary disease[J].Proc Am Thorac Soc,2006,3:475-476.

[6] Christman J W,Lancaster L H,BLACKWELL T S.Nuclear factor kappa B:a pivotal role in the systemic inflammatoryresponse syndrome and new target for therapy[J].Intensive Care Medicine,1998,24(11):1131-1138.

[7] Jutooru I,Chadalapaka G,Lei P,et al.Inhibition of NF{kappa}B and pancreatic cancer cell and tumor growth by curcumin is dependent on specificity protein downregulation[J]. Journal of Biological Chemistry,2010,13,285(33):25332-25344.

[8] 王立明,王新颖,潘莉雅,等.谷氨酰胺抑制单个核细胞细胞因子过度表达的研究[J].肠外与肠内营养,2010,17(1):29-31.

[9] Singleton K D,Wischmeyer P E.Glutamine attenuates inflammation and NF-kappaB activation via Cullin-1 deneddylation [J].Biochem Biophys Res Commun,2008,373(3):445-449.

[10] Singleton K D,Beckey V E,Wischmeyer P E.Glutamine prevents activation of NF-kappaB and stress kinase pathways,attenuates inflammatory cytokine release,and prevents acute respiratory distress syndrome (ARDS)following sepsis [J].Shock,2011,24(6):583-589.

Effect of glutamine on NF-κB and IL-6 expression in PBMC of patients with chronic obstructive pulmonary disease

Objective To determine the effects of glutamine on the nuclear factor kappa B(NF-kB)activity and IL-6 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD). Methods PBMCs were collected from COPD patients with acute exacerbation(AECOPD group,n=30),stable COPD patients(SCOPD group,n=30)and 15 health controls.Two COPD groups were further divided into 4 subgroups:blank control and glutamine(Gln) groups with 15 patients in each.The levels of NF-κBp65 and IL-6 gene expression in PBMCs were detected by real-time PCR. Results The expression of NF-κBp65 and IL-6 in blank control subgroups of AECOPD and SCOPD patients was higher than that in control group(P＜0.01).The expression of NF-κBp65 and IL-6 in AECOPD Gln subgroup was still higher than that in control group(P＜0.05),while there was no significant difference between control group and SCOPD Gln subgroup(P＞0.05); Compared with AECOPD and SCOPD blank subgroups,the expression of NF-κBp65 and IL-6 were decreased in AECOPD and SCOPD Gln subgroups(P＜0.05).Conclusion Glutamine can inhibit the activation of NF-κB and down-regulate IL-6 level in PBMCs of patients with chronic obstructive pulmonary disease.

COPD Glutamine PBMC NF-κB IL-6

2012-08-16）

（本文编辑：沈昱平）

杭州市卫生局基金项目（2011B009）

310009 杭州，安徽医科大学杭州临床学院（杭州市第三人民医院）呼吸内科

黄美健，E-mail：hmeijian@21cn.com