陆 芳,曲 佳
(天津市药品检验所,天津 300070)
葛根汤颗粒由葛根、麻黄、白芍、桂枝、甘草、大枣、生姜共7味中药组成,具有发汗解表,生津舒经的功效。适用于风寒感冒,证见:发热恶寒,鼻塞流涕,咳嗽咽痒,咳痰稀白,汗出,头痛身疼,项背强急不舒,苔薄白或薄白润,脉浮或浮紧[1-4]。处方中白芍具有养血调经,敛阴止汗,柔肝止痛,平抑肝阳的功效[5],现行质量标准为YBZ01562003-2009Z,尚无白芍的含量测定方法,现采用HPLC法,以芍药苷为定量指标,建立了处方中白芍的含量测定方法。修订后的质量标准方法简便、准确、专属性及重现性好,可用于葛根汤颗粒的质量控制手段之一。
日本SHIMADZU(岛津) LC-2010AHT高效液相色谱仪,LC-solution工作站。芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110736-201136,供含量测定用),葛根汤颗粒(山东瑞阳制药有限公司生产,批号12041511、12051211、12041710),乙腈为色谱纯,甲醇为色谱纯,水为去离子水。
2.1色谱条件Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;以乙腈-水(12∶88)为流动相;检测波长为230 nm;流速:1.0 ml/min;柱温:40 ℃;理论板数按芍药苷峰计算为8763,分离度1.7。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备取芍药苷钠对照品适量,精密称定,加20%甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液,即得。
2.2.2供试品溶液的制备取装量差异项下的本品,研细,取2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入20%甲醇50 ml,密塞,摇匀,称定重量,超声处理(功率200 W,频率40 kHz)40 min,放冷,再称定重量,用20%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2.3阴性对照溶液的制备按处方配比,取除白芍外的其他药材,按葛根汤颗粒的工艺方法,制得阴性样品,再按“2.2.2”项下方法制得阴性对照溶液。
2.3阴性对照试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μl,注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件分析,结果阴性对照样品在芍药苷峰对应的保留时间处无干扰,测定结果见图1。
1.芍药苷
2.4线性关系考查取芍药苷对照品,精密称定,加20%甲醇制成每1 ml含量分别为0.031 22、0.062 44、0.124 88、0.187 32和0.3122 mg的溶液,精密吸取上述6种溶液各10 μl,注入液相色谱仪,测定相应的峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。求得回归方程:Y= 5.5980×105X- 5.4324×103(r=0.9998)。结果表明,芍药苷在0.3122~3.122 μg范围内线性关系良好。
2.5进样精密度试验取“装量差异”项下批号为12041511的样品1份,按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件分析,连续进样6次,测定样品中芍药苷的平均峰面积为694972,其峰面积值的RSD为0.84%。
2.6重复性试验取“装量差异”项下批号为12041511的样品6份,按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作,按“2.1”项下色谱条件分析,测定每份样品中芍药苷的含量。结果6份样品平均含量为2.9196 mg/g,RSD为0.64%,结果表明本方法重复性良好。
2.7稳定性试验取“装量差异”项下批号为12041511的样品1份,按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作,按“2.1”项下色谱条件分析,分别在0、3、6、9和12 h测定,结果5次所得的芍药苷峰面积平均值为692361,其RSD为0.58%,结果表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.8回收率试验取“装量差异”项下批号为12041511的样品6份,各1 g,精密称定,精密加入用20%甲醇制成浓度为0.0581 mg/ml的芍药苷对照品溶液50 ml,再按“2.2.2”项下方法制得供回收率测定用的供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件分析,计算回收率。结果平均回收率为97.49%,RSD为1.11%,结果见表1。
表1 加样回收试验测定结果(n=6)
2.9样品测定取3个批号的样品,按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作,按“2.1”项下色谱条件分析,测定样品中芍药苷的含量,结果见表2。
表2 三批样品含量测定结果(n=2)
3.1波长及流动相的选择通过对芍药苷对照品溶液在200~400 nm处进行紫外光谱扫描检测显示,芍药苷在230 nm处有最大吸收,与文献[5]采用的波长一致。考查了不同组分的流动相及其比例,当流动相为甲醇-水(30∶70)时,样品中芍药苷色谱峰分离不完全,且出峰时间较慢,更换为乙腈-水(15∶85),试验发现,色谱峰分离情况仍不佳,且有杂质干扰,故将其比例调整为(12∶88),试验结果显示,系统保留时间适中,色谱分离情况较好,杂质干扰较少,因此,将其确定为流动相。
3.2提取方法的选择
3.2.1提取方式的选择分别考查了超声处理与加热回流两种提取方式,结果显示两种提取方式样品中芍药苷的含量相差不大,故采用操作相对较简便的超声处理方式。
3.2.2提取时间的选择分别考查了超声处理20、40及90 min。结果提取时间40 min与90 min,测定样品中芍药苷含量基本一致,故选择超声处理40 min。
3.2.3提取溶剂的选择分别采用了甲醇、50%甲醇、20%甲醇及10%甲醇作为提取溶剂。通过对所测结果比较,以20%甲醇作为提取溶剂时,测定结果高于其他提取溶剂,故选择20%甲醇作为提取溶剂。
3.3耐用性试验采用SHIMADZU(岛津) LC-2010AHT高效液相色谱仪,分别使用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱、phenomenex (Luna C18, 250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱、Agilent ZORBAX SB- C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,按“2.1”项下色谱条件分析,测定样品中芍药苷含量,三者RSD为1.57 %。结果显示,不同色谱柱对测定结果基本无影响。因此,建立的该含量测定方法耐用性良好,具有可行性。
1秦增祥.葛根汤药理与应用[J]. 古方研究,1996,(18):4
2阴继爱,戴岳,安树庞. 葛根汤的药理和临床研究概况[J]. 中华中医药学刊,2007,(6):25
3刘静. 葛根汤药理研究进展[J].第一军医大学学报,2005,(4):23
4冯维希. 葛根汤药理研究状况[J].中药导报,2009,29(1):45
5中国药典[S].一部.2010:147