HPLC法测定葛根汤颗粒中芍药苷的含量*

陆　芳，曲　佳

(天津市药品检验所，天津　300070)

葛根汤颗粒由葛根、麻黄、白芍、桂枝、甘草、大枣、生姜共7味中药组成，具有发汗解表，生津舒经的功效。适用于风寒感冒，证见：发热恶寒，鼻塞流涕，咳嗽咽痒，咳痰稀白，汗出，头痛身疼，项背强急不舒，苔薄白或薄白润，脉浮或浮紧[1-4]。处方中白芍具有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳的功效[5]，现行质量标准为YBZ01562003-2009Z，尚无白芍的含量测定方法，现采用HPLC法，以芍药苷为定量指标，建立了处方中白芍的含量测定方法。修订后的质量标准方法简便、准确、专属性及重现性好，可用于葛根汤颗粒的质量控制手段之一。

1　仪器与试药

日本SHIMADZU(岛津) LC-2010AHT高效液相色谱仪，LC-solution工作站。芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110736-201136，供含量测定用)，葛根汤颗粒(山东瑞阳制药有限公司生产，批号12041511、12051211、12041710)，乙腈为色谱纯，甲醇为色谱纯，水为去离子水。

2　方法与结果

2.1色谱条件Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；以乙腈-水(12∶88)为流动相；检测波长为230 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：40 ℃；理论板数按芍药苷峰计算为8763，分离度1.7。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备取芍药苷钠对照品适量，精密称定，加20%甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备取装量差异项下的本品，研细，取2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20%甲醇50 ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)40 min，放冷，再称定重量，用20%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备按处方配比，取除白芍外的其他药材，按葛根汤颗粒的工艺方法，制得阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制得阴性对照溶液。

2.3阴性对照试验分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析，结果阴性对照样品在芍药苷峰对应的保留时间处无干扰，测定结果见图1。

1.芍药苷

2.4线性关系考查取芍药苷对照品，精密称定，加20%甲醇制成每1 ml含量分别为0.031 22、0.062 44、0.124 88、0.187 32和0.3122 mg的溶液，精密吸取上述6种溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定相应的峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。求得回归方程：Y= 5.5980×105X- 5.4324×103(r=0.9998)。结果表明，芍药苷在0.3122～3.122 μg范围内线性关系良好。

2.5进样精密度试验取“装量差异”项下批号为12041511的样品1份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测定样品中芍药苷的平均峰面积为694972，其峰面积值的RSD为0.84%。

2.6重复性试验取“装量差异”项下批号为12041511的样品6份，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，按“2.1”项下色谱条件分析，测定每份样品中芍药苷的含量。结果6份样品平均含量为2.9196 mg/g，RSD为0.64%，结果表明本方法重复性良好。

2.7稳定性试验取“装量差异”项下批号为12041511的样品1份，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，按“2.1”项下色谱条件分析，分别在0、3、6、9和12 h测定，结果5次所得的芍药苷峰面积平均值为692361，其RSD为0.58%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8回收率试验取“装量差异”项下批号为12041511的样品6份，各1 g，精密称定，精密加入用20%甲醇制成浓度为0.0581 mg/ml的芍药苷对照品溶液50 ml，再按“2.2.2”项下方法制得供回收率测定用的供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件分析，计算回收率。结果平均回收率为97.49%，RSD为1.11%，结果见表1。

表1　加样回收试验测定结果(n=6)

2.9样品测定取3个批号的样品，按照“2.2.2”项下供试品溶液制备操作，按“2.1”项下色谱条件分析，测定样品中芍药苷的含量，结果见表2。

表2　三批样品含量测定结果(n=2)

3　讨论

3.1波长及流动相的选择通过对芍药苷对照品溶液在200～400 nm处进行紫外光谱扫描检测显示，芍药苷在230 nm处有最大吸收，与文献[5]采用的波长一致。考查了不同组分的流动相及其比例，当流动相为甲醇-水(30∶70)时，样品中芍药苷色谱峰分离不完全，且出峰时间较慢，更换为乙腈-水(15∶85)，试验发现，色谱峰分离情况仍不佳，且有杂质干扰，故将其比例调整为(12∶88)，试验结果显示，系统保留时间适中，色谱分离情况较好，杂质干扰较少，因此，将其确定为流动相。

3.2提取方法的选择

3.2.1提取方式的选择分别考查了超声处理与加热回流两种提取方式，结果显示两种提取方式样品中芍药苷的含量相差不大，故采用操作相对较简便的超声处理方式。

3.2.2提取时间的选择分别考查了超声处理20、40及90 min。结果提取时间40 min与90 min，测定样品中芍药苷含量基本一致，故选择超声处理40 min。

3.2.3提取溶剂的选择分别采用了甲醇、50%甲醇、20%甲醇及10%甲醇作为提取溶剂。通过对所测结果比较，以20%甲醇作为提取溶剂时，测定结果高于其他提取溶剂，故选择20%甲醇作为提取溶剂。

3.3耐用性试验采用SHIMADZU(岛津) LC-2010AHT高效液相色谱仪，分别使用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱、phenomenex (Luna C18, 250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱、Agilent ZORBAX SB- C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，按“2.1”项下色谱条件分析，测定样品中芍药苷含量，三者RSD为1.57 %。结果显示，不同色谱柱对测定结果基本无影响。因此，建立的该含量测定方法耐用性良好，具有可行性。

1秦增祥.葛根汤药理与应用[J]. 古方研究，1996,(18)：4

2阴继爱，戴岳，安树庞. 葛根汤的药理和临床研究概况[J]. 中华中医药学刊，2007，(6)：25

3刘静. 葛根汤药理研究进展[J].第一军医大学学报，2005，(4)：23

4冯维希. 葛根汤药理研究状况[J].中药导报，2009，29(1)：45

5中国药典[S].一部.2010:147