蒸馏水灭活胃癌术中用物携带肿瘤细胞的研究

喻晓芬 洪敏 张琴芳 胡弦琴 叶再元

蒸馏水灭活胃癌术中用物携带肿瘤细胞的研究

喻晓芬 洪敏 张琴芳 胡弦琴 叶再元

胃癌在我国的发病率及病死率均较高，胃癌根治术是治疗胃癌最直接有效的方法，只要患者条件允许又无明显远处转移，均应争取根治性切除，但手术操作往往会增加肿瘤细胞医源性播散的概率[1]。医源性播散是肿瘤术后复发的一个重要原因，术中用物如器械、敷料、手套、缝合器等，是术中切割、分离、结扎、止血的直接工具，随时可能被脱落肿瘤细胞污染而成为携带者。有研究发现，在肿瘤切除离体时器械的肿瘤细胞携带率为33.33%～46.67%，手术用物总体携带率为36.67%～90.00%[2]。本研究观察蒸馏水对术中被肿瘤细胞污染的手术用物的灭瘤效果，为被污染的手术用物寻找一种便捷、有效的术中处理方法，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌标本 选取2011-04—2012-02我院收治的无远处转移的胃癌患者90例，其中男58例，女32例，男女比例1.8∶1；年龄42～74岁，平均（50.2±12.5）岁；肿瘤位于胃窦部43例，胃体部24例，胃底贲门部23例。术前电子胃镜活组织病理切片提示：低分化腺癌58例，中分化腺癌24例，高分化腺癌8例；TNM分期：玉期10例，Ⅱ期34例，Ⅲ期46例；其中早期胃癌4例，进展期胃癌86例，均成功实施D2胃癌根治术。

1.1.2 仪器与试剂 RPMI 1640培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；细胞培养皿（Corning，美国）；CO2细胞培养箱（BB15，德国）；恒温水浴箱（DKB600B，中国）；苏木素、伊红（杭州捷程生物公司）；普通生物显微镜（CX31-12202，日本）；无菌蒸馏水（杭州民生药业有限公司，批号：11012258）；无菌0.9%氯化钠溶液（杭州民生药业有限公司，批号：11012272）；直径30cm的500ml干燥圆碗（高压蒸汽灭菌后备用）。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤细胞收集 术中肿瘤离体后以备用器械更换可疑污染器械，并更换手套及敷料。将90例患者手术的术中用物均分为5组，A：手术器械（血管钳8把、手术刀2把、剪刀2把、持针器2把、缝针4枚、拉钩3把、肠钳2把、有齿血管钳2把），B：术者手套（主刀、一助、二助），C：洗手护士擦器械及回收残线的纱条及手套，D：术中压迫止血及清洁术野的纱条、纱垫，E：缝合器。从开腹至肿瘤切除离体时所使用的5组手术用物分别浸泡在5只装有37℃500ml 0.9%氯化钠溶液的圆碗内，浸泡时手术用物必须完全浸没，剪刀、血管钳、持针器、肠钳等有关节器械须打开关节，浸泡30s后用无菌刷刷洗器械。收集浸泡液低速离心，无菌条件下收集离心后沉淀的细胞，于含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37℃，5%CO2培养箱中培养，具体见[3]。HE染色后由2位资深病理科专家镜下观察，参照患者离体组织的病理切片确认肿瘤细胞。

1.2.2 细胞检测 培养24h后将生长良好的肿瘤细胞进行爬片培养并分为两组，A组为氯化钠溶液对照组，B组为蒸馏水组，分别将爬片浸泡于37℃的灭菌蒸馏水或0.9%氯化钠溶液中，每组再分为6小组，分别浸泡20、30、45、60、90和120s。收集爬片以95%乙醇固定后常规染色，中性树胶封片后倒置显微镜下观察肿瘤细胞灭活效果。同样依上述方法进行不同温度45、50、55、60℃条件下浸泡并固定染色观察。取灭瘤效果最好的1组重复试验4次，细胞浸泡处理后更换含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基继续培养24h，观察肿瘤细胞的增殖能力。

1.2.3 判断标准 HE片由资深病理专家在普通生物显微镜下观察，每张玻片随机观察10个高倍视野（×400倍）。以细胞肿胀、胞膜破裂、核固缩和核碎裂为细胞坏死的形态学特征[4]。

1.2.4 细胞灭活率计算 单个标本各时间点灭活率=（对照组每高倍视野下肿瘤细胞数-蒸馏水组每高倍视野下肿瘤细胞数）/对照组每高倍视野下肿瘤细胞数× 100%，每个标本各时间段均计数3个高倍视野。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 不同温度和浸泡时间对肿瘤细胞的灭活情况 术中共浸泡处理手术用物450次，其中69次培养出肿瘤细胞，检出率15.30%（69/450）。55℃以下的温度梯度（37、45、50℃）的蒸馏水浸泡20、30、45、60、90和120s后，肿瘤细胞没有完全灭活。但相同温度的蒸馏水中，随着浸泡时间的延长，细胞灭活率逐渐增高；相同时间随着浸泡温度的升高，细胞灭活率也增高。37、45、50、55、60℃下不同浸泡时间的细胞灭活率均具有统计学差异（χ2= 54.01、113.89、65.51、111.63、147.23，均P＜0.01），见表1。

表1 蒸馏水组不同温度和时间肿瘤细胞灭活率比较（%）

2.2 不同温度和浸泡时间肿瘤细胞形态变化 在55℃的蒸馏水中浸泡60s后，肿瘤细胞出现肿胀，胞膜消失，胞质空泡化，细胞核体积缩小，核内染色质浓缩，部分染色质分解，核淡染，部分未见细胞核，并见细胞脱落，灭活率达100%，见图1B。而在55℃的0.9%氯化钠溶液中浸泡60s后，仅有部分细胞发生类似改变，还有部分细胞仅是体积增大，胞质略疏松，而细胞核形态无明显改变，见图1A。55℃蒸馏水浸泡60s后再培养24h，倒置显微镜下观察发现肿瘤细胞变圆、裂解，全部悬浮于培养液中，未见贴壁生长的有活性细胞。

图1 肿瘤细胞形态学观察（A：0.9%氯化钠溶液浸泡；B：蒸馏水浸泡；HE染色，×400）

3 讨论

恶性肿瘤的种植转移与外科手术关系密切[5]，胃癌患者行根治术后，半数以上最终死于腹膜种植转移[6]。腹腔内脱落癌细胞（exfoliated cancer cells,ECC）的存在是形成腹膜种植转移的先决条件，脱落癌细胞一方面来源于癌细胞浸透胃壁浆膜直接脱落到腹腔，另一方面由于手术时标本切缘的癌细胞脱落[7]，手术操作中不必要的挤压、牵拉，使更多的癌细胞逸出脱落，黏附到手术用物上，当再次使用则会引起新的脱落种植，甚至会形成携带、脱落种植链，增加癌细胞腹膜种植转移的机会[8]。在本研究中，浸泡处理的手术用物中肿瘤细胞检出率为15.30%，因此污染手术用物的肿瘤细胞灭活对于防止医源性的肿瘤播散具有重要意义。1954年提出无瘤操作的概念，是指在恶性肿瘤的手术操作中为减少或防止肿瘤细胞的脱落、种植和播散而采取的一系列措施[9]。有研究证实，严格的无瘤技术可以防止癌细胞的医源性播散[10]。目前，分组和更换器械是文献报道中器械减瘤处理的常用方法[11]；但执行有一定困难[12]，既增加手术成本和手术室护士的工作量，又影响手术进展而且增加器械遗漏在腔隙中的风险。因此，寻找一种快速、便捷、有效的方法处理术中肿瘤细胞污染的器械对减少人为因素造成的肿瘤播散有着重要的意义。

目前，对肿瘤细胞物理杀伤方法主要有以下几种：（1）利用渗透压差的作用，使肿瘤细胞肿胀裂解，从而失去活性；（2）利用肿瘤细胞对高温的敏感性明显高于正常细胞的特性，采用热处理的方式杀死肿瘤细胞；（3）紫外线照射造成细胞损伤，从而达到杀伤肿瘤细胞的作用，但是这种方式在手术中可行性不大。结合渗透压及热疗原理，笔者试图进一步寻求快速，简便、有效的肿瘤细胞灭活方法，从而避免术中肿瘤细胞的医源性播散。

作为一种低渗液体，蒸馏水的渗透压接近0，由于渗透压的差异，可以使肿瘤细胞肿胀裂解，从而失去活性。徐李娟等[13]报道受肿瘤细胞污染的器械经蒸馏水常温浸泡5min后，沾染的肿瘤细胞可被全部灭活，器械可以重新使用。但是术中浸泡器械5min再使用，就会导致手术和麻醉时间延长，增加手术风险；而且手术是一个连续过程，长时间等待会影响医生对手术器械的选择[14]，限制了这些方法在临床上应用。本研究利用蒸馏水的低渗透压以及热疗对肿瘤细胞的杀伤作用，浸泡受肿瘤细胞污染的胃癌手术用物，促使肿瘤细胞自发破裂、溶解,从而达到灭活肿瘤细胞的目的。

本研究发现相同温度的蒸馏水中，随着浸泡时间的延长，细胞灭活率逐渐增高；而相同浸泡时间随着温度的升高，细胞灭活率也增高。经55℃蒸馏水浸泡60s后，未见存活细胞；55℃蒸馏水浸泡60s后再培养24h，肿瘤细胞悬浮，失去增殖能力。同时调查研究发现洗手护士戴着乳胶手套的手对55℃能忍受，长时间浸泡其中不会烫伤；另外调查了270位手术医生，93.30%的医生认为术中等待器械浸泡60s可以接受。以此为依据，术中受肿瘤细胞污染的用物经55℃蒸馏水浸泡60s后，可全部灭活黏附的肿瘤细胞，手术用物可以重新使用；既有效的预防了肿瘤细胞的种植和播散，又不会因为术中长时间浸泡影响手术进程，避免了术中频繁更换用物，从而也可以减少手术成本。

综上所述，胃癌手术中可疑污染器械在55℃蒸馏水中浸泡60s后，灭瘤效果好，作用时间短，有效防止肿瘤细胞的种植及播散，而且蒸馏水价格低廉容易获取，可节省手术成本，为胃癌手术的无瘤操作提供了一种新途径。

[1] 赵蕊,杨华,顾玮瑾,等.我国恶性肿瘤手术中无瘤操作技术的进展[J].中华护理杂志,2007,42(8):730-732.

[2] 张剑英,杨美玲,吴玉松,等.手术用物携带肿瘤脱落细胞的病理学观察[J].护理学杂志,2007,22(16):57-58.

[3] 章静波,陈实平,刘玉琴,等.人肿瘤细胞培养[M].北京:化学工业出版社,2006:1.

[4] 李玉林.病理学[M].北京:人民卫生出版社,2008:18.

[5] 季加孚.胃肠道恶性肿瘤外科的无瘤技术和原则[J].中国实用外科杂志,2005,25(4):254-256.

[6] Wang Z,Zhang X,Xu H,et al.Detection of peritoneal microme-tastasis by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for heparanase mRNA and cytology in peritoneal wash samples[J].J Surg Oncol,2005,90(2):59-65.

[7] Marutsuka T,Shimada S,Shiomori K,et al.Mechanisms of peritoneal metastasis after operation for non-serosa-invasive gastric carcinoma an ultrarapid detection system for intraperitoneal free cancer cells and a prophylactic strategy for peritoneal metastasis [J].Clin Cancer Res,2003,9(2):678-685.

[8] 孙跃民.胃癌术后腹膜种植转移与腹腔温热化疗[J].国外医学·肿瘤学分册,2002,29(6):446-449.

[9] 张贵年,黄顺荣.无瘤操作技术在胃肠恶性肿瘤外科治疗中的应用进展[J].中国实用外科杂志,2010,30(3):232-233.

[10] Atkin G,Chopada A,Mithcell I.Colorectal cancer metastasis:in the surgeon's hands[J]?Int Semin Surg Oncol,2005,2(1):5.

[11] 马莉,郝晓玲.恶性肿瘤手术应用无瘤技术过程的护理配合[J].护理研究,2010,24(36):3348-3349.

[12] 张剑英,杨美玲,吴玉松,等.肝素生理盐水刷洗祛除手术器械肿瘤细胞[J].护理学杂志,2010,25(16):55-56.

[13] 徐李娟,陈肖敏,吕柄建,等.蒸馏水和生理盐水浸泡术中污染器械灭活肿瘤细胞的实验研究[J].中华护理杂志,2005,40(11):810-811.

[14] Reymond M A,Bien N,Pross M,et al.The status of Portsite Recurrence[J].Kongressbd Dtsch Ges Chir kongr,2001,118(9): 187-191.

（本文编辑：胥昀）

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