幼儿颊黏膜脱落细胞钙离子含量与龋病活跃性检测结果的关系

魏利敏 王剑锋 石四箴

幼儿颊黏膜脱落细胞钙离子含量与龋病活跃性检测结果的关系

魏利敏 王剑锋 石四箴

目的 探讨幼儿颊粘膜脱落细胞钙离子含量与幼儿患龋状况以及幼儿龋病活跃性检测结果的关系。方法将50例3～5岁幼儿根据龋蚀指数分为两组：龋病高危组26例、无龋组24例。采用Dentocult SM、Dentocult LB、Cariostat、SCAT 4种方法对幼儿进行龋病活跃性检测。取幼儿颊黏膜脱落细胞，Fluo-3染色，用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+的荧光强度值，统计分析其与龋病活跃性的关系。结果高危组幼儿Ca2+荧光强度低于无龋组（P＜0.01）；高危组幼儿颊黏膜内Ca2+的荧光强度与dft、CSI均呈直线负相关关系（均P＜0.01）；3岁组Ca2+荧光强度高于5岁组（P＜0.05）；Ca2+荧光强度分别与Dentocult SM、Dentocult LB及SCAT结果呈等级负相关关系（P＜0.05或0.01）。结论3～5岁幼儿颊黏膜钙离子荧光强度与患龋状况具有一定的相关性，龋坏程度重则细胞内钙离子荧光强度低。幼儿颊黏膜细胞内钙离子的荧光强度可作为筛选龋病易感儿童的一项参考指标。

颊黏膜细胞 钙离子 激光扫描共聚焦显微镜 荧光强度 龋活跃性

Association of calcium ion levels in buccal cells with caries activity in children

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the association of calcium ion levels in buccal cells with caries activity in children.MethodsFifty children aged 3～5 were enrolled in the study,including 26 with high caries-susceptibility and 24 caries-free children.Dentocult SM,Dentocult LB,Cariostat and SCAT tests were applied on all individuals.The buccal surface cells were collected and stained with Fluo-3,the fluorescent intensity of calcium ions was measured by laser scanning confocal microscope.ResultsThe fluorescent intensity of calcium ions in caries-free group was higher than that in high caries-susceptibility group(P＜0.01).The fluorescent intensity was negatively correlated with dft,CSI indexes in high caries-susceptibility group (P＜0.01).The fluorescent intensity was higher in age group 3 than that in age group 5 (P＜0.05).Negative spearman correlations were found between fluorescent intensity and Dentocult SM,Dentocult LB,SCAT test results(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05 respectively).ConclusionThe calcium ion levels in buccal cells are negatively correlated with caries status in children aged 3～5,which suggests that fluorescent intensity of calcium ions in buccal cells might be used as an indicator to screen high caries-susceptibility children.

【 Key words】Buccal cell Calciumions Fluorescent intensity Caries activity test Laser scanning confocal microscope(LSCM)

1 对象和方法

1.1 对象 2011—09-10随机抽取某幼儿园幼儿50例（3～5岁，其中3岁幼儿14例，4岁幼儿27例，5岁幼儿9例），乳牙列均完整，无口腔急性疾病、急性系统性感染性疾病、慢性疾病、代谢性疾病、遗传性疾病及发育异常。检查幼儿的全口牙齿并记录，患龋牙标明龋蚀牙面，计算龋补牙数（dft）及龋蚀指数（CSI）。以龋患程度为指标将受检儿童分为无龋组（dft=0，CSI=0）24例，男14例，女10例，年龄3～5岁，平均3.7岁；高危组（dft≥5，CSI≥10）26例，男18例，女8例，年龄3～5岁，平均4.1岁。两组幼儿性别及年龄的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 龋病活跃性检测 分别用Dentocult SM（芬兰O-rion Diagnostisca公司）、Dentocult LB（芬兰Orion Diagnostisca公司）、Cariostat（日本三金株式会社）及SCAT（中国石四箴研制）4种试剂盒对受试幼儿进行唾液链球菌计数、唾液乳酸杆菌计数及菌斑产酸能力检测[7-8]，所有操作严格遵循试剂盒说明书。

1.3 颊黏膜细胞的采集、处理 采集前50ml 0.9%氯化钠溶液漱口3次，受检儿平坐，头稍仰，测试者左手以口镜拉开小儿口角，右手执白色塑料小刮片。适当用力，刮取颊黏膜脱落细胞，采样面积约3.0mm2。将小刮片置于内有1.0ml PBS（pH值7.4）的Eppendorf管中洗3～5下，使细胞溶于储存液。在含有细胞的Eppendorf管内加入配制好的荧光染料Fluo-3/AM（浓度为1μmol/L）10μl，37℃二氧化碳培养箱孵育30min。而后1 000r/min离心分离5 min，连续3次。用移液管小心吸出上层液，最后一次吸去上层液后，加入1ml PBS，震荡器上震荡1min，将含细胞的PBS溶液倒入放置于37℃恒温工作台上的培养皿内静置5min，待细胞下沉后收集。

1.4 钙离子荧光强度测定 采用CLSM（LSM510型，德国ZEISS公司生产）测定细胞内钙离子的荧光强度。每例样本选取3个视野，3个视野内细胞数之和不少于50个。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，计量资料均以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用q检验，相关性采用直线相关与回归分析及Spearman相关分析。

2 结果

2.1两组钙离子荧光强度比较 无龋组、高危组钙离子荧光强度分别为93.80±9.73、54.03±11.10，差异有统计学意义（t=13.421，P＜0.01）。两组幼儿钙离子荧光图见图1-2。

图1 无龋组钙离子荧光图像

图2 高危组钙离子荧光图像

2.2 不同年龄幼儿钙离子荧光强度的比较 3、4、5岁幼儿钙离子荧光强度分别为 49.25～113.90（83.92± 21.79）、34.98～101.91（71.99±21.36）、35.38～96.32（59.68± 21.41），3岁幼儿钙离子荧光强度明显高于5岁幼儿（P＜0.05），而3岁与4岁、4岁与5岁幼儿间钙离子荧光强度的差别均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 高危组钙离子荧光强度与dft、CSI的直线相关与回归分析 高危组钙离子荧光强度与dft、CSI明显相关（r=-0.457、-0.511，P＜0.05或0.01），其直线回归散点图见图3-4。

图3 高危组钙离子荧光强度值与dft直线回归散点图

图4 高危组钙离子荧光强度值与CSI直线回归散点图

2.4 钙离子荧光强度与龋病活跃性检测结果的相关性 钙离子荧光强度与Dentocult SM，Dentocult LB及SCAT实验结果高度相关（r=0.534、0.420、0.431，均P＜0.01），但与Cariostat检测结果无相关性（r=0.193，P＞0.05）。

3 讨论

本实验结果显示，无龋组颊黏膜细胞内钙离子荧光强度显著高于高危组，可见颊黏膜细胞内钙离子浓度和患龋状况存在一定的关系。唾液作为颊黏膜细胞生存的外环境，其pH值、矿物质离子浓度、不饱和脂肪酸含量等理化特性和颊黏膜细胞内钙离子浓度处于一种动态联系中[9-10]。无龋组唾液中的钙离子浓度较高，可能会导致细胞内外钙离子浓度在一个更高的水平保持平衡；相反，高危组唾液中钙离子浓度较低，可能会导致细胞内外钙离子浓度在一个较低的水平保持平衡[11]。

另外，本文结果还显示，3岁幼儿颊黏膜细胞钙离子荧光强度高于5岁幼儿，推测其可能原因如下：（1）龋病严重程度不同，5岁幼儿龋病病程长于3岁幼儿，早期的龋齿发展到5岁时往往已经是残根残冠，而3岁幼儿的龋齿多是1年之内的新发龋齿[12]。（2）5岁幼儿患龋牙数可能多于3岁幼儿。（3）既往研究发现，口腔变形链球菌于19～31个月时定居幼儿口腔，并且随着年龄的增加，细菌数量也不断增加[13]。由此可以推测，5岁幼儿唾液中变形链球菌产酸能力高于3岁幼儿，唾液pH值低于3岁幼儿，一定程度上影响了钙离子荧光强度，但是否是导致3岁与5岁幼儿细胞钙离子荧光强度不同的因素，尚待进一步探讨[14]。此外，口腔中大部分乳酸杆菌附着于颊黏膜表面，而乳酸杆菌具有很强的代谢产酸能力，是否会导致颊黏膜部位的pH值低于口腔其它部位，也尚待验证[15]。

综上所述，颊黏膜细胞内钙离子荧光强度可作为龋病活跃性的一个检测指标，为幼儿龋病活跃性检测提供了一条新途径。

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2012-12-13）

（本文编辑：欧阳卿）

325027 温州医学院附属口腔医院（魏利敏、王剑锋）；同济大学儿童口腔医学研究所（石四箴）

王剑锋，E-mail：dentwjf@163.com