噬菌体在鲍曼不动杆菌耐药过程中的作用

周园，王岚，李旗，冯伟，刘新*

(1.沈阳医学院辽宁省环境污染与微生态实验室，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳市第四人民医院重症医学科)

噬菌体是感染细菌的病毒，具有溶原性和裂解性两种生长方式[1]，根据与宿主菌的相互关系，分为温和噬菌体和毒性噬菌体二种类型。过去人们关注毒性噬菌体裂解宿主菌，期待发挥治疗性应用，但长期研究并未取得实质性进展[2]。鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛分布于外环境中，黏附力极强，是引起医院内感染的重要条件致病菌之一，在住院患者特别是重症监护室(intensive care unit，ICU)患者中引起严重感染，本研究对临床分离的Ab菌株进行耐药性分析及细菌超微结构观察，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集 标本分别来自沈阳市多家医院ICU，包括患者痰、呼吸机导管及手术的引流管等，临床检查判定为Ab，经LB肉汤培养基增菌，然后转种于青霉素+诺氟沙星培养基上培养。单个菌落经中国蓝培养基，44 ℃连续传代纯化，生化反应测定符合不动杆菌属，细菌鉴定仪鉴定到种。将经过鉴定的菌株通过肉汤培养基增菌24 h，比浊法调细菌的密度为1×108/ml，备用。

1.2 试剂与仪器 营养琼脂培养基，中国蓝培养基(北京奥博星生物技术有限公司)，革兰阴性杆菌鉴定试剂条(REF 32100 梅里埃公司)，药敏纸片(OXOID 公司)。质控菌株为大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心，Ab标准株：ATCC 19606(宝特生物公司代购)，本室保存传代。ATB细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)，S-4800冷场发射扫描电镜(日立公司北京办事处)。

1.3 菌种鉴定 标本直接涂片，革兰染色；氧化酶、触酶、硝酸盐还原试验及动力试验。ATB生化鉴定分析仪鉴定，操作步骤按照说明书进行。

1.4 药敏试验 采用K-B 纸片扩散法，判定标准按照CLSI 2012版执行[3]。

1.5 扫描电镜标本制备 将具有泛耐药的菌株以1 200 rpm离心2 min，得到细菌集团，取少量转入盛有预冷的2.5%戊二醛固定剂EP(eppendorf)管中固定，4 ℃过夜。4 ℃条件下0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min×3次，1%锇酸固定液固定2 h，0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min×3次，脱水：50%乙醇15～20 min，70%乙醇15～20 min，90%乙醇15～20 min，90%乙醇、90%丙酮(1∶1)15～20 min，90%丙酮15～20 min。固化：37 ℃过夜。镀膜20 s。S-4800冷场发射扫描电镜观察。

2 结果

2.1 药敏试验 45株Ab对抗生素的药敏试验见表1。

表1 45株Ab对抗生素的药敏试验(%)

2.2 耐药Ab超微结构观察 经呼吸机导管分离的耐药Ab表面可见数个噬菌体附着，噬菌体头部呈多边形，未见尾丝结构，菌体完整无破损，对照株菌体表面光滑，未见噬菌体吸附，见图1。

3 讨论

目前报告Ab的耐药机制比较复杂，包括耐药酶或称药物灭活酶的产生；外膜蛋白的减少、缺失或突变；药物外排泵的形成；药物作用靶位：青霉素结合蛋白表达减低或缺乏及可移动遗传元件参与的耐药基因的传递等，但关于Ab形态结构与耐药性关系鲜有报告。

噬菌体在自然界广泛分布，凡是有细菌的场所，就有相应噬菌体的存在。噬菌体的形态结构一般分成三种类型：即无尾部结构的二十面体，有尾部结构的二十面体和线状体[4]。本试验中观察到Ab耐药株的噬菌体为多边形，未见尾丝结构，故应属无尾部结构的二十面体噬菌体，本室保存的Ab标准菌株ATCC19606，为细菌生物被膜模式株[5]，未见噬菌体存在，药敏试验表明对多种抗生素敏感，提示耐药菌株上的温和噬菌体与其耐药有关。

温和噬菌体是指噬菌体感染细菌后，并不裂解宿主菌引起死亡，关于温和噬菌体与不动杆菌溶原性及与耐药相关性目前未见有报道。我们观察到噬菌体吸附于Ab表面，菌体形态完整，无裂解迹象，说明宿主菌处于溶原状态，如果噬菌体将其自身的基因组整合于宿主菌中的染色体中，这种整合意味着宿主菌基因组变化，是否因此导致耐药性有待于进一步研究。

值得注意的是电镜下还观察到Ab存在性菌毛多重接合现象。呈分枝状的性菌毛，使接合的机会更多，这种现象未见有文献报道。因为性菌毛能在细菌之间传递DNA，是细菌产生耐药性的原因之一，本实验结果提示溶原性细菌可能通过噬菌体启动耐药基因，而由性菌毛多重接合，将耐药基因广泛传递使细菌快速产生了耐药性，应予以关注。

多边形噬菌体吸附于细菌表面，每一菌体表面均有数个噬菌体吸附，噬菌体头部直径小于200nm菌体形态保持球杆状，无细胞壁破裂A 临床分离的耐药菌株菌体球杆状，表面光滑，无细胞壁破裂B ATCC19606(实验室保存株)菌毛附着于菌体：短而直、中空管状，末端有多处分枝C 耐药的Ab菌毛菌体间可见分枝的菌毛呈多向接合D Ab耐药株多向接合

图1 Ab扫描电镜图片(×25 000)

参考文献：

[1]李凡，刘晶星．医学微生物学[M]．7版．北京：人民卫生出版社，2008：68-77．

[2]梁莉，杨洪江，金鑫．鲍曼不动杆菌烈性噬菌体的分离与纯化[J]．生物学杂志，2010，27(4)：88-90，93.

[3]孙长贵，王辉．抗菌药物敏感性试验执行标准(M100-S22)[J]．中华检验医学杂志，2012，32(3)：172.

[4]闻玉梅．精编现代医学微生物学[M]．上海：复旦大学出版社，2002：123.

[5]Gaddy JA，Andrew P，Tomaras AP，et al．The Acinetobacter baumannii 19606 OmpA protein plays a role in biofilm formation on abiotic surfaces and in the interaction of this pathogen with eukaryotic cells [J]．Infect Immun，2009，77(8)：3150-3160．