瘤胃酸中毒的微生物学研究进展

■李 鹏刘敏跃于立辉龙 淼 郭 洋 何剑斌

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.辽宁省农牧业机械研究所有限公司，辽宁沈阳 110036)

瘤胃酸中毒是因反刍动物采食大量的谷类或其它富含碳水化合物的饲料后，导致瘤胃内乳酸和挥发性脂肪酸（VFA）蓄积而引起的一种代谢性酸中毒。正常情况下，反刍动物瘤胃内pH值维持在6左右，一般认为，瘤胃内pH值在5.0～5.6之间发生亚临床酸中毒，pH值＜5.0即发生急性酸中毒。酸中毒时瘤胃pH值下降，势必引起瘤胃内微生物种群发生改变。Hungate研究表明，当动物摄入过量的碳水化合物时可以导致瘤胃微生物菌群发生显著的变化，这种变化包括以下几个方面：①分解纤维素的细菌数量急剧减少；②纤毛虫死亡；③革兰性阳性菌数量增加；④非挥发性酸积聚；⑤挥发性酸浓度下降[1]。本文主要对瘤胃酸中毒时瘤胃内微生物学研究现状做一综述。

1 瘤胃酸中毒与瘤胃内细菌

瘤胃内诸如淀粉和糖类等可发酵底物增加，导致瘤胃内某些细菌生长速率和发酵活性增强，进而引起瘤胃内乳酸和VFA蓄积，发生酸中毒。瘤胃酸中毒引起的细菌变化主要包括可发酵淀粉和可溶性糖类的细菌以及可发酵乳酸的细菌种群的改变。

1.1 淀粉分解菌和产乳酸菌

许多瘤胃内细菌均可以降解淀粉并利用其中间产物（淀粉糊精、麦芽糖、葡萄糖等）。在饲喂高碳水化合物日粮的动物中，淀粉分解菌可以占瘤胃内细菌总数的90%～95%。瘤胃内可以利用淀粉、麦芽糊精以及麦芽糖的细菌种类主要包括：月形单胞菌属（Selenomonas）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、链球菌属（Streptococcus）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、真菌属（Eubacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、光岗菌属（Mitsuokella）、瘤胃杆菌（Ruminobacter）、琥珀酸单胞菌属（Succinimonas）以及琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）[2]。但有关每种细菌的淀粉分解活性以及乳酸和VFA的产量尚不清楚。

1.1.1 反刍月形单胞菌

反刍月形单胞菌，一种月形单胞菌属的革兰氏阴性杆菌，是瘤胃中的一种优势菌种，对于饲喂富含碳水化合物饲料的动物来说其浓度持续增加。它可能是动物适应高碳水化合物日粮最主要的一种微生物。反刍月形单胞菌并不发酵淀粉或其他多糖，但可以利用麦芽糖、糖类和一些寡糖类。因此，它依赖于可降解高分子聚合物的细菌而存在。基于其利用乳酸和甘油的能力，可以将瘤胃内月形单胞菌分成两类：可以利用乳酸和甘油的菌株被划分为反刍月形单胞菌乳酸分解亚种（Selenomonas ruminantium ssp.lactilytica），而其它所有菌株全被划为反刍月形单胞菌反刍亚种（Selenomonas ruminantium ssp.ruminantium）。因此，反刍月形单胞菌既可以产生乳酸又可以利用乳酸。反刍月形单胞菌反刍亚种是瘤胃内主要的微生物（约占饲喂谷物饲料动物瘤胃内细菌总数的22%～51%），而反刍月形单胞菌乳酸分解亚种仅占很小的比例[3]。

1.1.2 牛链球菌

牛链球菌是一种兼性厌氧菌，通常存在于牛的瘤胃、盲肠和结肠中。在以牧草作为主要饲料的动物瘤胃内牛链球菌数量并不高（104～107个/g瘤胃内容物），但是当碳水化合物发酵过度时其数量可以达到1011个/g瘤胃内容物。尽管许多瘤胃内细菌可以分解淀粉，但以牛链球菌效果最好，这主要是由于牛链球菌具有快速的生长速率以及其对淀粉降解迅速[4]。牛链球菌通常是混合酸发酵模式（产物为乙酸、蚁酸以及乙醇），但当底物过量及pH值＜5.6时其可以转变为纯乳酸发酵模式（产物仅是L-乳酸）。尽管纯乳酸发酵比混合酸发酵产生较少的ATP，但牛链球菌有着极高的发酵效率，其每小时产生的ATP比其他瘤胃内细菌产生的要多。在牛链球菌中，可以在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下将丙酮酸转变为乳酸或在丙酮酸蚁酸裂解酶（PFL）的作用下转变为乙酰辅酶A和蚁酸，随后乙酰辅酶A转变为乙酸或乙醇。乳酸产量增加主要是由于当菌体外pH值低于5.0时菌体内pH值下降至5.5，而LDH在pH值5.5时活力最强。相反，PFL的最适pH值为7.5，当pH值6.0时其活力下降10%。此外，两种酶的活性均受别构剂的影响，LDH受果糖-1、6-二磷酸的影响，而PFL受二羟基丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸的影响[5]。牛链球菌内LDH和PFL的合成可能还受其转录水平的调控[6]。

尽管普遍认为牛链球菌具有一定的耐酸性，但其耐酸性并没有乳酸杆菌那样强，当瘤胃pH值＜6.0时其生长速度下降，且随着乳酸杆菌数量的增加链球菌数量减少，表明二者之间可能存在拮抗作用。而Well在1997年发现了一种由发酵乳酸杆菌产生的细菌素，可以对牛链球菌产生抑制作用[7]。此外，在牛链球菌中存在一个种间密度感应系统（quorum sensing，QS）LuxS/AI-2。LuxS信号系统以LuxS蛋白作为关键酶，合成信号分子自体诱导物-2（autoinducer-2，AI-2）。AI-2是一种呋喃硼酸二酯分子，介导不同细菌间相互交流。尽管在纯化的培养基中LuxS基因的转录与细胞密度不直接相关，但AI-2的活性可能对菌体的生理和代谢具有调节作用以使其适应瘤胃条件的变化[8]。

牛链球菌产生的乳酸导致瘤胃pH值下降，使瘤胃内大多数微生物生长受到抑制，从而使耐酸的乳酸杆菌占优势。目前，普遍认为牛链球菌是一系列产酸反应开始，并最终导致急性瘤胃酸中毒的发生。因此，牛链球菌被认为是引发急性酸中毒的最主要的病原菌，目前主要的预防和治疗措施如抗生素和疫苗的应用也都是以控制瘤胃内牛链球菌的生长为主要靶点。

1.1.3 乳酸杆菌

乳酸杆菌和链球菌相比耐酸性更强，这也是在酸中毒的瘤胃中（pH值＜5.6）乳酸杆菌占优势的主要原因。瘤胃内乳酸杆菌数量显著增加是急性和亚急性酸中毒共有的一个特征[9]。瘤胃同时拥有同型发酵（产物为L-和D-乳酸）和异型发酵（产物为乳酸、乙酸和乙醇）两种类型的乳酸杆菌，由于瘤胃内存在的乳酸杆菌种类繁多，所以通常很难在物种水平上对分离的菌株进行鉴定，而是通常将其统称为乳酸杆菌属。Sharpe在采食谷物日粮为主的牛瘤胃内分离鉴定了两种主要的乳酸杆菌：瘤胃乳杆菌（L.ruminis）和犊乳杆菌（L.vitulinus），前者主要产生L（+）乳酸，而后者仅产生D（-）乳酸[10]。

1.1.4 其它淀粉分解菌

双歧杆菌是革兰氏阳性杆菌，可以从饲喂富含淀粉日粮的动物瘤胃内分离得到。双歧杆菌不能利用淀粉，但其可促进麦芽糖和葡萄糖的代谢。双歧杆菌可以利用多种可溶性糖类，并且通过一种特殊途径（果糖-6-磷酸途径）来发酵葡萄糖，使其以摩尔比3∶2的比例生成乙酸和乳酸。丁酸弧菌是具有与革兰氏阳性菌相似的细胞壁的革兰氏阴性杆菌，它们在瘤胃内细菌总数中占很大比例。尽管通常丁酸弧菌被人认为是分解纤维素的主要细菌，但一些菌株具有淀粉酶活性，可以利用葡萄糖产生大量的乳酸[11]。溶淀粉琥珀酸单胞菌，是一种革兰氏阴性杆菌，通常认为其与淀粉消化有关，可以利用葡萄糖产生大量琥珀酸和少量乙酸以及蚁酸[12]。嗜淀粉瘤胃杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，是饲喂谷物类饲料动物瘤胃内分解淀粉的一类主要的细菌。然而，它对底物有一定的限制，仅能利用淀粉、淀粉糊精、麦芽糖，不能利用游离的葡萄糖，这可能是由于其不能转运葡萄糖通过菌体壁膜间隙而造成的[13]。

1.2 乳酸利用菌

乳酸是瘤胃发酵的中间产物，可以进一步转变为VFA。瘤胃主要通过增加乳酸利用菌的数量来适应高谷物类日粮。瘤胃内可以发酵乳酸的细菌主要包括：埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii）、反刍月形单胞菌乳酸分解亚种（Selenomonas ruminantium ssp.lactilytica）、解脂厌氧弧菌（Anaerovibrio lipolytica）、梭杆菌属（Fusobacterium necrophorum）、消化链球菌属（Peptostreptococcus asaccharolyticus）以及痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）和小韦荣球菌（Veillonella parvula）。在这些微生物中，埃氏巨球形菌和反刍月形单胞菌乳酸分解亚种是饲喂谷物饲料的动物发酵乳酸的主要菌种[14]。

1.2.1 埃氏巨型球菌

埃氏巨型球菌是一种革兰氏阴性大球菌，是瘤胃内发酵乳酸的最重要的一种微生物。因此，它对防止采食谷物类饲料的动物瘤胃内乳酸堆积有着重要的作用。埃氏巨型球菌并不能利用淀粉，但其可以利用麦芽糖和葡萄糖，因此，他依赖于其它具有淀粉分解活性的细菌以获得能量底物。埃氏巨型球菌可以发酵瘤胃内约60%～80%的乳酸。埃氏巨型球菌的这种作用的主要原因可能是由于其具有一定程度的耐酸特性并且其对乳酸的发酵作用不受葡萄糖或麦芽糖等代谢产物的抑制。在体外纯化培养条件下，埃氏巨型球菌直到乳酸被耗尽后才开始利用葡萄糖[15]。埃氏巨型球菌主要将乳酸转变为乙酸、丙酸、丁酸及少量己酸和戊酸。L-乳酸通过转变为丙烯酸而最终生成丙酸，而D-乳酸通过不依赖NAD的D-LDH而转变为丙酮酸或者通过乳酸消旋酶转变为L-乳酸。D-乳酸产生的丙酮酸随后代谢生成乙酸、丁酸、戊酸或己酸，并产生ATP。乳酸发酵产物的摩尔比例受葡萄糖水平和菌株差异的影响。在葡萄糖存在的条件下，丁酸、戊酸、己酸产量增加而同时丙酸产量下降[16]。埃氏巨型球菌可以利用乳酸产生丙酸，但并不能利用葡萄糖产生丙酸，主要原因可能是由于葡萄糖可以抑制其乳酸消旋酶的活性[17]。

1.2.2 反刍月形单胞菌乳酸分解亚种

反刍月形单胞菌乳酸分解亚种代谢乳酸主要生成琥珀酸和丙酸。尽管反刍月形单胞菌可以耐受低pH值，但反刍月形单胞菌乳酸分解亚种在酸性条件下生长速率较低。此外，反刍月形单胞菌乳酸分解亚种对乳酸的发酵可以被糖类抑制[18]。与埃氏巨型球菌相比反刍月形单胞菌利用乳酸的活性较差，主要是由于葡萄糖可以抑制其LDH的活性，但在埃氏巨型球菌并没有这种现象[19]。

1.2.3 其它乳酸利用菌

小韦荣球菌，是一种革兰氏阴性小球菌，其16S RNA序列与反刍月形单胞菌相近，可以发酵乳酸使其转变为乙酸和丙酸，但并不能发酵任何形式的糖类。解脂厌氧弧菌是一种能分解脂肪和甘油的微生物，主要与饲喂粗饲料或从粗料向精料转变的动物瘤胃内的乳酸发酵有关，而对于已经适应了精料的动物的乳酸发酵可能并没有显著作用[20]。1953年，Gutierrez利用乳酸培养基从瘤胃内容物中分离得到了痤疮丙酸杆菌[21]。Mackie等报道，厌氧弧菌属和丙酸杆菌属是采食高碳水化合物日粮的羊瘤胃内主要的乳酸利用菌[22]。

2 瘤胃酸中毒与纤毛虫

与细菌相似，瘤胃内纤毛虫的数量也随着可利用底物的增加而增加。适当增加碳水化合物的摄入可以导致纤毛虫数量大幅度增加。而饲喂高浓度或完全碳水化合物日粮可以产生截然相反的结果，甚至导致某些动物体内纤毛虫完全消失[23]。一般认为，纤毛虫对pH值的波动和下降的变化要比细菌敏感，因此，瘤胃pH值是维持瘤胃内纤毛虫数量的关键因素。瘤胃内纤毛虫数量显著减少，甚至在某些情况下完全消失，是急性和亚急性酸中毒共有的一个特征。瘤胃内各种纤毛虫中，内纤毛虫属（Entodinium）、双纤毛虫属多甲亚属（Polyplastron）、均纤毛虫属（Isotricha）和密纤毛虫属（Dasytricha）等对低pH值均有一定的耐受能力[24]。内纤毛虫属是瘤胃内原虫中对低pH值耐受能力最强的，这也是其在瘤胃内的数量最多的原因，在饲喂高碳水化合物日粮的牛瘤胃内大约占总数的90%～99%[25]。

纤毛虫对瘤胃内淀粉和乳酸代谢有着重要的作用。就乳酸产生来说，均纤毛虫属和密纤毛虫属可以发酵淀粉或糖类产生两种形式的乳酸，而内纤毛虫属产生乳酸的量却很少[26]。在另一方面，乳酸发酵主要与内纤毛虫属有关而与均纤毛虫属无关。尽管纤毛虫对于瘤胃内乳酸产量及其代谢的作用尚不清楚，但目前普遍认为纤毛虫的数量与瘤胃内乳酸浓度呈负相关。这可能是由于纤毛虫可以吸收淀粉和糖类，从而使其避免了被细菌发酵而引起的。更为重要的是，由于其与细菌间的相互作用，纤毛虫还可能对乳酸的产生和蓄积有着间接的影响，主要是由于其捕食活性可以导致瘤胃内细菌密度下降。因此，纤毛虫在一定程度上可以降低瘤胃内淀粉发酵速率。而淀粉发酵缓慢导致VFA产量稳定以及采食后瘤胃内pH值升高。细菌活力下降说明在饲喂高谷物日粮的动物中纤毛虫对瘤胃发酵产生了缓慢的影响。因此，对于饲喂谷物类饲料的牛来说，纤毛虫具有一定的缓冲效应。但事实却恰恰相反，纤毛虫对于饲喂高谷物日粮的牛的瘤胃代谢所产生的作用并不显著，因为淀粉为主的日粮可以显著减少甚至清除瘤胃内的纤毛虫种群。

3 展望

尽管许多研究人员多年以来一直致力于研究瘤胃酸中毒中微生物的变化，但对于瘤胃pH值波动引发的微生物变化的认识仍然存在较大分歧。目前，研究瘤胃内微生物区系特别是细菌和真菌的方法还是依赖于传统的培养方法，而传统的培养方法有着一定的局限性，主要是因为其不能全面分析整个生态系统之间的关系。同样，尽管核酸技术在评价和监测瘤胃内微生物变化方面更敏感、精确，可以准确鉴定含量较少的细菌，但对其具体功能的研究尚存在一定的局限性。因此，瘤胃酸中毒的研究必须致力于应用先进的分子生物学技术和其它菌体分离和定量的技术，进一步鉴定各菌种的功能及相互关系，确定瘤胃内各类细菌对瘤胃酸中毒的具体作用。