地衣芽孢杆菌与日粮蛋白水平对肉鸡生产性能、肠道环境及免疫器官指数的影响

■孙小沛 杨在宾 李兆勇 胡振新 杨维仁 姜淑贞

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2.北京科为博生物科技有限公司，北京 100000；3.山东天禧牧业有限公司，山东惠民 251700）

人们对于抗生素作为饲料添加剂使用可能导致的细菌抗生素耐药性的关注度越来越高，欧盟已经于2006年1月1号开始禁止了抗生素作为饲料添加剂在畜禽生产中的使用[1]。益生素作为“抗生素替代品”中的一种，能否完全替代亚治疗量抗生素对动物的有益影响，是近年来研究的热点问题。益生菌主要有芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌和双歧杆菌等，其中地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中最有潜力的菌种之一[2]。国内外对单一芽孢杆菌菌株研究主要集中在枯草[3-6]、凝结芽孢杆菌[7-9]，鲜见对地衣芽孢杆菌的研究。芽孢杆菌是目前已知最稳定的益生素菌株，体外研究证明其适合在颗粒料生产中添加[10]，但国内外对芽孢杆菌的研究中很少使用颗粒料[11-13]，而实际肉鸡生产中多使用颗粒料，因此本试验将地衣芽孢杆菌应用于常规杂交肉鸡颗粒型日粮中，进行大群饲养。本研究旨在通过比较在不同蛋白水平日粮中添加地衣芽孢杆菌和抗生素对肉鸡生产性能、肠道盲肠微生物、消化道pH值及免疫器官指数的影响，为地衣芽孢杆菌在肉鸡上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

地衣芽孢杆菌（Bacillus Licheniformis，B.Licheniformis），购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 菌剂

地衣芽孢杆菌制剂经固体发酵工艺生产而成，粉状，活菌含量为2×1010cfu/g，由科为博（北京）生物科技有限公司提供。

抗生素：杆菌肽锌（10%）和硫酸粘杆菌素（10%），由山东天禧牧业有限公司提供。

1.3 试验设计

采用2×2析因试验设计，试验因素为2个蛋白水平（0～21 d：20.80%与20.30%；22～35 d：19.3%与18.8%，标记为H-CP与L-CP）和2种促生长添加剂（抗生素与地衣芽孢杆菌，标记为AntiB与ProB），抗生素的添加量为杆菌肽锌200 mg/kg和硫酸粘杆菌素40 mg/kg，地衣芽孢杆菌的添加量为200 mg/kg。4个处理分别为H-CP+AntiB、HCP+ProB、L-CP+AntiB、L-CP+ProB。

选用1日龄山东地方杂交鸡（AA肉鸡♂×褐壳蛋鸡商品代♀）商品肉仔鸡约24万只，随机分成4个处理，每个处理6个重复，每个重复约1万只。试验期分1～21日龄和22～35日龄两个阶段进行。

1.4 试验日粮

试验日粮参照该商品杂交鸡养殖营养水平推荐量配制。高蛋白日粮是指按推荐量配制的日粮，低蛋白日粮是在推荐量基础上最终营养水平降低0.5%CP含量的日粮。日粮分1～21日龄和22～35日龄两个阶段配制，组成和营养水平见表1。抗生素和益生素添加水平在两个阶段保持一致。

表1 试验日粮组成和营养水平

1.5 饲养管理

试验鸡网上饲养，自由采食、饮水；光照：第1周24 h/d，第2周以后23 h/d；温度：第1周保持33～35℃，以后每周降低2℃，直到24～28℃；平均饲养密度：育雏期35～45只/m2，以后逐步疏散至10只/m2；免疫：7日龄新城疫+鸡传染性支气管炎二联苗以及禽流感疫苗点眼、滴鼻及注射，12日龄传染性法氏囊滴口。

1.6 检测指标和检测方法

1.6.1 生产性能

试验期间每天记录采食量、死亡鸡数，并且于21日龄和35日龄早晨饲喂前，按鸡群数量的1%抽检空腹鸡重，计算ADG、ADFI和F/G。

1.6.2 盲肠微生物

采用陈天寿等[14]的方法，无菌取盲肠内容物1.0 g于盛有9 ml灭菌生理盐水及玻璃珠的锥形瓶内,进行10倍递比稀释。取合适稀释倍数的稀释液于灭菌后的培养基上37℃恒温培养48 h后计数，结果以lgcfu/g表示。乳酸菌、大肠杆菌分别用麦康凯琼脂培养基（海博生物科技，HBPM016）和MRS培养基（海博生物科技，BPM0384）培养。

1.6.3 消化道pH值

屠宰后，剥离出胃肠道，用便携式pH计分别测定十二指肠、空肠和回肠每段肠道的前1/4处、后1/4处及中点处食糜的pH值，用平均值表示。

1.6.4 免疫器官指数

屠宰后，摘取脾脏、法氏囊和左侧胸腺,剔除脂肪，用电子天平称鲜重。免疫器官指数（g/kg）=免疫器官重/宰前体重。

1.7 数据处理

用SAS 9.1软件采用ANOVA中的因子方差分析，主要影响有蛋白水平、益生素和蛋白水平×益生素，P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 对生产性能的影响（见表2）

表2 不同蛋白质水平添加益生素对肉鸡生产性能的影响

由表2可知，相比于抗生素，地衣芽孢杆菌对0～21 d肉鸡的生产性能无显著影响（P＞0.05），肉鸡22～35 d的日增重在高蛋白（19.3%）和低蛋白（18.8%）组分别提高了2.17%和3.30%（P=0.038），并有增加后期（22～35 d）日采食量、35 d体重及全期日增重的趋势（P＜0.1）；地衣芽孢杆菌使肉鸡全期（0～35 d）的料肉比有所降低，但差异不显著（P＞0.05）。不同蛋白水平对肉鸡的生产性能无显著影响（P＞0.05），蛋白水平和地衣芽孢杆菌对生产性能的交互作用不显著。上述结果表明，地衣芽孢杆菌替代抗生素作为促生长添加剂在肉鸡日粮中应用，有改善肉鸡生长性能的趋势。

2.2 盲肠微生物(见表3)

由表3可见，采食地衣芽孢杆菌的肉鸡相比于抗生素组21 d和35 d盲肠内大肠杆菌的数量显著降低（P＜0.05），显著增加了21 d和35 d乳酸菌的数量（P＜0.05）。蛋白水平对盲肠微生物的影响不显著，蛋白水平和地衣芽孢杆菌无显著交互作用（P＞0.05）。

表3 不同蛋白质水平添加益生素对肉鸡盲肠微生态菌群的影响（lgcfu/g）

2.3 肠道pH值（见表4）

由表4可知，饲喂由地衣芽孢杆菌替代抗生素日粮的肉鸡，其21 d回肠、盲肠和直肠的pH值显著降低（P＜0.05），35 d空肠、回肠和盲肠的pH值存在降低的趋势（P＜0.1）。低蛋白水平有降低21 d直肠和35 d空肠pH值的趋势（P＜0.1）；在18.8%蛋白日粮中添加地衣芽孢杆菌，35 d空肠的pH值的降低程度大于高蛋白（19.3%）组，但交互作用分析不显著（P=0.092）。上述结果表明，日粮中添加地衣芽孢杆菌显著降低了肉鸡前期中后段肠道的pH值，而对后期肠道的影响不显著。

2.4 免疫器官指数（见表5)

表4 不同蛋白质水平添加益生素对肉鸡肠道pH值的影响

表5 不同蛋白质水平添加益生素对肉鸡免疫器官指数的影响（g/kg）

由表5可知，饲喂地衣芽孢杆菌的肉鸡21 d的胸腺指数较饲喂抗生素的肉鸡显著增加(P=0.031)，显著提高了35 d的胸腺指数(P=0.035)和法氏囊指数(P=0.035)，对脾脏指数无显著影响(P＞0.05)。不同蛋白水平对免疫器官指数的影响不显著，蛋白水平和地衣芽孢杆菌对免疫器官指数无显著交互作用。上述结果表明，地衣芽孢杆菌可以促进肉鸡免疫器官的发育。

3 讨论

3.1 生产性能

本试验结果表明，地衣芽孢杆菌替代日粮中抗生素，有增加杂交肉鸡全期（0～35 d）平均日增重的趋势，且主要是通过后期（22～35 d）的促生长效果体现出来的，这与一些研究结果相一致。Fritts等[4]研究表明，与抗生素相比，在日粮中添加枯草芽孢杆菌显著降低了肉鸡21～42 d料肉比，而对0～21 d和全期料肉比无显著影响。胡长庆等[15]研究发现，芽孢杆菌的促生长作用具有时间上的累积效应，随着试验时间的延长，试验组日增重与对照组的差异越来越明显。

抗生素能在肉鸡饲养前期迅速杀灭肠道内一些致病菌，有利于肉鸡前期的健康，却破坏了肉鸡肠道微生态菌群平衡，而益生素主要是通过调理肉鸡肠道健康达到促生长作用，这个过程可能需要一段时间，因此本试验中地衣芽孢杆菌对生长性能的改善作用主要发生在后期。郝生宏等[16]将4株耐制粒益生菌（地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳链球菌及啤酒酵母制剂）经制粒后饲喂0～3周龄AA肉仔鸡，发现各试验组雏鸡存活率均高于对照组，腹泻率均低于对照组。同样，用枯草芽孢杆菌粉剂饲喂樱桃谷肉鸭，42日龄肉鸭的饲料转化效率和育成率均显著高于基础日粮和液态芽孢杆菌制剂[17]。然而另有研究与本试验结果不尽相同，在Mutus等[18]的研究中，枯草芽孢杆菌对AA肉仔鸡的饲料转化效率并未有显著的改善。Teo等[6]发现，添加抗生素杆菌肽锌抗生素日粮对肉鸡的增重效果优于芽孢杆菌，这可能与动物品种、芽孢杆菌菌株、添加量和饲养环境等因素有关。地衣芽孢杆菌对生长性能的改善可能与其对肠道微生态菌群的影响有关。Djouzi等[19]研究表明，益生菌可以通过提高消化道微生物菌群平衡而有益于宿主的微生物区系健康。而且，胃肠道内的微生物能调节肠上皮细胞的活性和组织功能的表达，对于改善生长性能有一定作用[20]，本试验结果中肠道酸度和菌群的改善也可证明这一说法。

刘艳芬等[21]研究发现，日粮粗蛋白质水平为20.69%、21.56%和22.43%的三个处理之间，21 d肉鸡的生产性能无显著差异。宋宇轩等[22]研究表明，饲喂粗蛋白水平为18%日粮的肉鸡其生产性能显著优于16%和20%CP水平。本试验不同蛋白水平（0～21 d：20.80%与20.30%；22～35 d：19.3%与18.8%）对肉鸡生产性能无显著影响，可能与两个蛋白水平之间梯度相差较小有关，这说明低蛋白水平满足或超过该杂交肉鸡的蛋白需要量。

3.2 肠道环境

动物体胃肠道酸度是影响消化环境的重要因素，同时也是调节体内酸碱平衡和电解质平衡的基础条件，适宜的酸度是维持消化系统正常生理功能的关键。禽类消化道几乎都处在酸性环境中，这有利于保证消化酶的活性，抑制病原微生物的生长繁殖[23]。陈家祥等[2]研究表明，地衣芽孢杆菌能抑制大肠杆菌，促进有益菌生长。王洪燕[24]研究发现，在21 d肉鸡日粮中添加不同剂量地衣芽孢杆菌，空肠pH值较抗生素组显著降低，直肠有降低的趋势，但对盲肠微生物无显著影响。本试验用地衣芽孢杆菌替代抗生素后显著改善了21 d和35 d肉鸡盲肠微生物菌群平衡；显著降低了肉鸡21 d回肠、盲肠和直肠的pH值，对35 d肠道的影响不显著。

通常认为乳酸菌益生素对肠道的酸化作用较为显著[25]，Jin等[26]研究比较了枯草芽孢杆菌和乳酸菌对肉鸡肠道菌群的影响，结果发现，小肠内乳酸菌和大肠杆菌的数量在两个处理之间几乎无差异。尽管芽孢杆菌不是动物正常肠道菌群中的重要成员，且不能在肠道内长期定植，但它们能快速消耗肠道内的游离氧，降低pH值，这有利于支持乳酸菌，抑制大肠杆菌；另一方面，尽管可能芽孢杆菌所分泌的消化酶不足以提高生产性能，但由这些酶分解产生的各种营养成分，如乙酸、丙酸等，却能在一定程度上改变肠道的菌群结构[5]。畜禽体内的有益菌和病原菌对pH值很敏感，低pH值（4～5）利于乳酸菌和链球菌的生长，而高pH值（6～7）则有益于大肠杆菌繁殖[27]。乳酸菌属细菌的增加，反过来通过代谢产生酸性代谢产物维持了肠道的低pH值环境，有利于乳酸菌的繁殖和消化酶发挥活性。

也有研究报道，饲喂益生菌并没有改善肠道乳酸菌的数量，作用效果不如抗生素[28]。在对抗生素（金霉素、粘杆菌素等）作用效果的研究中发现，抗生素能降低肉鸡前期后段肠道的大肠杆菌等有害菌数，对乳酸菌等有益菌增加不显著，且随着着饲养时间的延长，对有害菌的作用效果变得不明显，说明细菌对抗生素逐渐产生了耐药性，抗生素对肠道菌群平衡的改善是短暂性的[29-30]。肠道内的微生物系统是庞大的，不同菌之间的关系错综复杂，并且受到很多其他因素的影响，地衣芽孢杆菌对肠道环境的改善还需进一步研究证实。

蛋白质在消化道内发酵被视为能引发肠道失调和致病菌增殖的一个潜在风险[31-32]，蛋白质发酵除了会产生一些短链脂肪酸，还会释放一些可能刺激肠道黏膜的物质，例如氨、粪臭素、吲哚等，增加消化道黏度，使发生腹泻的几率增加。Hermes等[33]报道，过高的蛋白含量会导致仔猪结肠内蛋白质发酵程度增加，结肠内异位酸和氨的含量显著增加，仔猪的腹泻较严重。而侯永清等[34]研究发现，20%的蛋白水平使仔猪腹泻率高于18%蛋白，但从结肠内容物中挥发性盐基氮的含量来看，不同蛋白质水平并未影响蛋白质的发酵，这与本试验研究结果相似。不同的蛋白质水平之间未观察到肠道环境的明显差异，可能是蛋白质水平及蛋白含量差异较小，不足以导致蛋白质肠道发酵的明显改变。

3.3 免疫

脾脏、胸腺和法氏囊是禽类最重要的免疫器官，其中脾脏是禽类最大的外周免疫器官，胸腺是细胞免疫的中枢器官，法氏囊则是禽类特有的体液免疫器官[35]。地衣芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，其细胞壁含有肽聚糖（peptidoglycan，PG）和多糖（polysaccharide，PS），PG 和PS能直接活化宿主的巨噬细胞、内皮细胞和中性粒细胞等免疫系统，进而促进免疫器官的生长发育[27]；益生菌在动物肠道内大量繁殖，产生的维生素和氨基酸类有益物质是动物免疫器官生长发育必不可少的原料[36]；此外，芽孢杆菌在发酵的过程中可以产生一些具有免疫活性的成分，能以免疫佐剂的形式作用于免疫器官，有利于免疫器官的生长发育。本研究证明，地衣芽孢杆菌能促进肉鸡胸腺和法氏囊的发育，对脾脏指数无显著影响，说明地衣芽孢杆菌对肉鸡免疫器官的生长具有积极作用，能增强机体细胞免疫和体液免疫机能。Panda等[37]和Cross[38]的研究也指出，益生菌能刺激机体的保护性免疫反应，增强机体抵御微生物致病菌的能力。有研究报道，雏鸡由于免疫系统不成熟，可能对由机会致病菌造成的感染特别敏感[39-40]，因此在饲养早期添加微生态制剂对于增强肉鸡的免疫力会达到理想的效果[41]，本试验地衣芽孢杆菌组肉鸡35 d免疫器官指数的显著提高可能正是早期免疫反应增强的效果累积所致。

4 结论

①与抗生素相比，地衣芽孢杆菌有增加杂交肉鸡后期（22～35 d）生产性能的趋势。

②与抗生素相比，地衣芽孢杆菌可通过调节盲肠微生态、降低前期后段肠道pH值来改善肉鸡肠道环境，能显著提高免疫器官指数。

③ 日粮蛋白水平的差异（0.5%）对杂交肉鸡的生长无显著影响，与促生长添加剂之间的交互作用不显著。