凝结芽孢杆菌产芽孢培养基及培养条件优化

■吴逸飞 赵旭民 黄小晖 李继光汤江武

（1.浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021；2.义乌市华太饲料有限公司，浙江义乌 322005；3.株洲智荟生物科技有限公司，湖南株洲 412003）

乳酸菌是一类能够发酵利用糖产生乳酸的细菌统称。一般乳酸菌不易存活，对环境的抗逆性差，不能够耐高温，耐酸和耐胆盐，因此乳酸菌制品普遍存在着保存性差、易失活等缺点。

凝结芽孢杆菌是一类能够形成芽孢的乳酸菌，它除了具有一般乳酸菌的维持肠道微生态平衡，提高机体消化功能和健康水平外，还具有耐高温，耐酸、耐胆盐等优点，能有效抑制有害菌的生长，改良肠道微生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能，在饲料行业有很好的应用前景，被美国食品与药物局（FDA）列入可用于饲料的安全微生物菌种名单。由于凝结芽孢杆菌的芽孢具有易保藏、复活率高等特点，因而是乳酸菌商品化制剂的重要形式。目前如何通过培养条件调控，使凝结芽孢杆菌的产芽孢率提高是研究重点。本文在前期筛选获得一株凝结芽孢杆菌B2的基础上，尝试采用液态发酵方式，通过PB试验设计优化其培养基组成及培养条件，以期进一步提高凝结芽孢杆菌的产芽孢数，为后期制剂的大规模生产提供数据依据。

1 材料和方法

1.1 材料

菌种：凝结芽孢杆菌B2为本实验室筛选，于-20℃保存。

发酵培养基：YPD培养基，成分为葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，加水至1 L，pH值7.0，115℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化：将保存的菌种转接到种子培养基，37℃培养24 h,备用。

1.2.2 种子液的制备：从斜面上挑取一环培养物接种到装有20 ml培养液的50 ml三角瓶中，于30℃、220 r/min条件下震荡培养24 h，备用。

1.2.3 发酵培养：将上述种子培养液按1%的接种量接种于发酵培养基，装液量100 ml，于30℃、220 r/min条件下摇瓶培养48 h。

1.2.4 培养基的单因素试验：首先通过PB试验确定影响芽孢得率的显著培养基成分，再通过对显著成分的单因素试验，确定其最佳添加量。

1.2.5 培养条件的优化：在获得最佳培养基的基础上，对接种量以及发酵模式（震荡、静置）进行逐一优化。

1.2.6 计数方法

凝结芽孢杆菌的活菌总数采用稀释平板计数法；芽孢计数则采用把培养后菌液于80℃水浴15 min后稀释涂平板计数。

2 结果与分析

2.1 不同培养原料对液体发酵产芽孢能力的影响

在试验过程中发现凝结芽孢杆菌B2在若干培养基平板上有产芽孢的能力，其中以加入淀粉的平板产芽孢最早，在24 h产生，以加入蛋白胨的平板为最高，因此，综合考虑，我们选择几种工业上发酵罐中常用的碳氮源作为PB实验的筛选因子，具体方案和结果见表1。结果分析见表2。

表1 液体发酵培养基产芽孢能力的PB实验

表2 PB实验的各因素方差分析结果

由表2可知，试验模型的R2值为0.91，表明实验有91%的数据能够用此模型拟合，模型情况较好。Shapiro-Wilktest表明数据符合正态分布。同时由表2可见，各因素的作用显著性排序为：蛋白胨＞淀粉＞大豆粉＞葡萄糖＞酵母膏＞K2HPO4＞(NH4)2SO4。其中显著的因素为蛋白胨、大豆粉和淀粉。

2.2 凝结芽孢杆菌芽孢形成培养基的确定

根据2.1节所获得的结果，我们选择了蛋白胨、淀粉和大豆粉等3个因素为考察对象，其余因素取低水平。对此3因素进行单因素实验，摸索它们的最佳添加量。

表3 蛋白胨、淀粉和大豆粉的单因素实验

由表3可知，淀粉最佳的添加量为0.2%、蛋白胨最佳添加量为0.5%、大豆粉最佳添加量为1.0%，结合2.1节的结果，确定凝结芽孢杆菌发酵产芽孢的最佳培养基为淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO40.02%。

2.3 接种量的单因素实验

在确定发酵培养基的基础上，进一步研究了初始种子接种量对发酵后芽孢数的影响，结果见表4。

表4 初始接种量对发酵后芽孢得率的影响

由表4可知，随着初始种子接种量的增加，发酵后的芽孢数量也逐步提高，考虑到生产实际，合理的接种量应该控制在3%～5%。

2.4 不同的培养方式对凝结芽孢杆菌芽孢得率的影响

研究表明，提高通气量有助于凝结芽孢杆菌转变为芽孢，而静置培养又可提高初始菌数。因此我们选取了3种不同的作用方式，结果见表5。由表5可知，最佳的培养方式为连续摇瓶的方式，在此条件下，芽孢数量可以达到3.5×108cfu/ml。

表5 不同氧气控制方式对凝结芽孢杆菌的促进作用

3 讨论

随着微生态制剂研究成为饲料添加剂研究的热点，乳酸菌在动物饲养中的优势逐步显现。但绝大多数乳酸菌存在抗逆性差，不耐热的缺点，给制剂的保藏、运输都带来了较大困难，由于无法保证产品有效性，无法直接添加到配合饲料中使用。芽孢杆菌由于芽孢的生成，具有抗逆性强、耐高温和易储存等特点，很好地弥补了乳酸菌的不足，因而产乳酸芽孢杆菌的研究已成为益生菌菌株研发的热点。许多研究报道，凝结芽孢杆菌在碳源缺乏的情况下才会形成芽孢，在碳源充足的情况下不形成芽孢，菌体会发生自溶。同时无机盐在调控芽孢形成中发挥重要的作用，Mn2+对芽孢形成起到显著的影响，PO43-也有利于芽孢的形成，而K+和Na+对凝结芽孢杆菌的形成无明显的促进作用。

4 结语

本试验通过研究表明最佳液体发酵培养基为淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO40.02%。培养条件接种量为2%～3%（v/v），培养方式为震荡培养。在此条件下，芽孢数量可以达到3.5×108cfu/ml，优化后凝结芽孢杆菌产芽孢的能力都有了很大的提高。另一方面，本试验初步研究了凝结芽孢杆菌液体发酵芽孢形成的条件，还有一些因素值得探讨，比如培养温度，pH值以及培养时间等；培养温度过低会导致菌体生长缓慢，不利于芽孢形成；过高的温度会使菌体发生自溶，也不利于芽孢形成，因而有待进一步研究。

（参考文献15篇，刊略，需者可函索）