小反刍兽疫诊断技术及其疫苗研究进展

杨翠玲

（潍坊市经济学校，山东 诸城 262200）

小反刍兽疫（PPR）是一种严重的烈性、接触性传染病。FAO/OIE规定PPR为A类烈性传染病，我国规定为一类动物疫病。其病原是小反刍兽疫病毒（PPRV），其与牛瘟病毒（RPV）同属于副黏病毒科麻疹病毒属，PPRV曾被错误的认为是RPV的变异株，二者能产生交叉免疫保护作用，因此常用牛瘟疫苗预防PPR，直到20世纪70年代后期才证明PPRV不同于RPV。

PPRV主要感染小反刍兽，山羊高度易感，不同品种的山羊易感性不同，欧洲品系的山羊更易感，幼龄动物易感性较高，哺乳期的动物抵抗力较强；猪和牛也可感染，但通常无临床症状，通过调查PPR的流行过程，牛、猪及昆虫在传播该病过程中未起到作用；瞪羚、努比亚野山羊、东方盘羊及长角羚有死亡的报道；另外证实PPRV可以克服大型反刍动物的先天抵抗力，感染骆驼、水牛等反刍动物[1-3]。自然感染PPRV后，典型临床特征是高热（41℃）、流泪、眼鼻分泌物增多、严重腹泻、口舌溃疡、支气管肺炎，严重感染时发病率和病死率都可以达到100%。目前该病主要通过早期诊断和疫苗免疫的方式进行控制[4]。

世界上第一例PPR于1942年发生在非洲的科特迪瓦，本病曾经给非洲、中东等地区的小反刍动物养殖业带来严重灾害。到2006年初，我国周边国家孟加拉国、尼泊尔、印度、巴基斯坦等先后暴发PPR疫情，近几年呈现蔓延趋势。2007年7月我国首例小反刍兽疫疫情在西藏发生，并经国家外来动物疫病诊断中心确诊，作为一种动物外来疫病，该病已严重威胁到我国小反刍兽的健康，因此对该病开展研究具有重要意义[5]。

1 诊断技术

PPR的确诊须依赖于实验室检测，目前实验室诊断方法主要有9种。

1.1 琼脂凝胶免疫扩散试验

琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验在临床中广泛应用，该方法简单、便宜，可在基层实验室甚至野外操作，反应18～24 h可获得结果。但对于临床中比较常见的温和型PPR来讲，AGID试验的敏感性不足以检测到分泌物中含量较低的抗原，故不适用于PPR的早期诊断。

1.2 对流免疫电泳

学者用对流免疫电泳（CIEP）和AGID两种检测方法同时检测PPR病料，CIEP可以检测到80.3%的阳性率，而AGID的检测阳性率是42.6%，说明CIEP的敏感性较高。Osman等用CIEP及竞争ELISA（c-ELISA）两种方法同时检测519个血清样本，CIEP的阳性率是59.15%，c-ELISA的阳性率为50.67%，说明CIEP的敏感性高于c-ELISA，但是CIEP试验的缺点是不能区别RPV感染[6]。鉴于CIEP较高的敏感性，因此在无条件进行c-ELISA的地区或者实验室，CIEP可作为一种有用的筛选试验，用于PPRV的临床检测。

1.3 间接荧光抗体试验

学者通过PPRV的单克隆抗体建立间接荧光抗体试验（IFAT），能特异性地检测出早期及晚期病料中的PPRV。另外，以重组PPRV F蛋白为抗原，免疫家兔，制备其多克隆抗体，以制备的多克隆抗体为一抗，用于捕获病料中的抗原，以羊抗兔的IgG作为二抗，通过IFAT能特异性的诊断出PPRV[7]。

1.4 病毒分离鉴定

PPRV的培养分离可以选用原代羔羊肾细胞及非洲绿猴肾细胞。培养5～6 d后，细胞变圆、收缩，最终形成合胞体，其细胞核呈圆形，犹如表盘状排列；因CPE出现时间较晚，5～6 d后应进行盲传继代，进一步鉴定需要借助病毒中和试验（VNT）或电子显微镜[8]。由于其试验要求较高，需要大量人力物力，不利于基层实验室开展检测工作。

1.5 中和试验

在国际贸易中，中和试验（VNT）是PPR指定诊断方法，该方法灵敏、特异，但是通常需要10～12 d，试验要求较高，不适合大规模样品检测。其转管培养通常在原代羔羊肾细胞或者非洲绿猴肾细胞进行，通过与RPV进行交叉中和试验，可以与RPV进行鉴别诊断[9]。

1.6 ELISA

应用ELISA方法监测血清的方法已经十分成熟，而且有多种试验方法。

1.6.1 竞争ELISA

动物感染PPRV后，其血清中抗体一部分是针对PPRV N蛋白和H蛋白的，基于其单克隆抗体建立c-ELISA检测方法[8]。另外，将RPV碳端可变区在大肠杆菌中进行表达，用作c-ELISA抗原，鉴别诊断RPV和PPRV感染。c-ELISA是OIE的标准检测方法之一，现已开发出标准c-ELISA检测试剂盒，用于检测血清或者血浆中的PPRV N蛋白抗体。此方法耗时较短，能实现检测的大量化，敏感性为94.5%、特异性为99.4%，与经典的病毒中和试验具有较高的相关性，因此得到广泛应用。

1.6.2 夹心ELISA

夹心ELISA（S-ELISA）方法的原理是用多克隆抗体捕获临床样品中的PPRV抗原，用针对PPRV N蛋白的单克隆抗体检测捕获的抗原。Singh等试验表明，S-ELISA特异性达92.8%，敏感性达88.9%，2 h内可获得试验结果，特别适合临床样品的检测，缺点是不能鉴别诊断RPV；另外由于S-ELISA具有迅速、简单的特点，因此可替代VNT，用于PPR疫苗质量控制[10]。

1.6.3 间接ELISA

基于血清中的多抗，Balamurugan等建立了间接ELISA（i-ELISA）方法，特异性和敏感性分别达95.09%及90.81%。Zhang等克隆了在中国西藏爆发的PPRV N蛋白基因，并在大肠杆菌中表达，以此建立i-ELISA方法，分析697份血清表明，敏感性和特异性分别是96.7%及96.1%[11]。分析比对发现，PPRV NP蛋白的452-472位区域的多肽序列是PPRV特异的，并且具有较强的免疫原性，其产生的抗体能特异地识别PPRV，因此可以鉴别诊断PPRV及RPV。鉴于其较高特异性及敏感性，因此i-ELISA方法可以取代国外昂贵的试剂盒用于PPR的实验室诊断。

1.7 核酸探针杂交试验

目前已克隆出PPRV各个基因，并建立了核酸探针杂交检测方法。针对PPRV N蛋白基因的cD⁃NA探针可以鉴别诊断PPRV及RPV，由于32P的半衰期较短以及放射性元素危害较大等原因，核酸探针杂交试验成为一种常规诊断方法不太现实。

1.8 聚合酶链式反应

Balamurugan等建立了针对N、M基因的一步法多重聚合酶链式反应方法（RT-PCR），可鉴别诊断RPV[12]。基于PPRV N、H、M蛋白基因，Georg等建立了多重RT-PCR方法，研究证实M基因的PCR敏感性最高，N、H及F基因依次次之，可以鉴别诊断PPRV和RPV；基于PPRV N蛋白基因，建立了一步法实时定量RT-PCR法，能够检测血液样本，与常规RT-PCR相比，具有敏感性更高且减少PCR污染的优势[13]。鉴于PCR快速、特异、灵敏、高通量的优势，PCR检测方法在PPRV的诊断中将发挥重大优势。

1.9 PCR-ELISA

基于PPRV N基因，Saravana等建立了PCRELISA检测方法，通过RT-PCR扩增地高辛标记的336 bp产物，然后通过ELISA检测，该方法灵敏度比传统RT-PCR高10 000倍，在对临床样本的检测中，其敏感性高于S-ELISA[14]。因此该方法比S-ELISA更适用于早期感染及感染后期的检测，同时能进行PPRV与RPV的鉴别诊断。

2 疫苗研究进展

2.1 RPV弱毒疫苗

RPV弱毒疫苗曾在西非广泛应用于绵羊和山羊的免疫，不但可以控制RP，又可以预防PPR，免疫保护效果较好，其原因是PPRV与RPV具有较高的抗原相关性。但是该疫苗不利于RP的无疫认证。Walsh等将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入牛瘟弱毒RBOK疫苗株，构建成重组病毒RPV⁃SIG-GFP，免疫接种后，RPV和PPRV的强毒均不能使其感染，其产生的抗GFP抗体可用于区别自然感染和疫苗免疫动物[15]。

2.2 PPR弱毒疫苗

20世纪80年代末，PPRV毒株在非洲绿猴肾细胞成功致弱，该株疫苗属于Ⅰ群，但是交叉保护作用较强，无任何毒副作用，因此广泛用于PPR的预防；通过冷冻干燥可极大提高其热稳定性，利于基层运输及使用；免疫后，保护性抗体可维持12个月，母源抗体较高，可在4月或者5月龄首免；缺点是不能区分野毒及疫苗毒[16]。另外，Rashid将巴基斯坦当地的PPRV毒株经细胞致弱后，免疫山羊及绵羊21 d后，采用c-ELISA方法，可以检测到较高水平的抗体，抗体可以维持1年[17]。

2.3 PPR灭活疫苗

同源的PPR灭活疫苗通常使用感染PPRV山羊的病理组织进行制备，研究表明，氯仿的灭活效果优于甲醛，用氯仿灭活后免疫动物，血清抗体可持续8个月，但是无法区分野毒株和疫苗株。

2.4 重组亚单位疫苗

用纯化的重组杆状病毒表达的HN蛋白具有良好的免疫原性，无需使用佐剂，低剂量免疫山羊后，能产生中和PPRV和RPV的抗体。通过原核表达PPRV和RPV的NP蛋白，经过纯化，单剂量、无需佐剂的前提下免疫小鼠即可产生免疫应答。Khandelwal等表达PPRV HN蛋白，其免疫表位具有天然构象，绵羊口服后，能产生中和抗体，且能使细胞介导其免疫反应[18]。与PPR弱毒疫苗相比较，重组亚单位疫苗耐热性能稳定，且持续时间比较长，因此在PPR防控中占有极大优势。

2.5 嵌合体疫苗

利用PPRV的F和H、M蛋白基因代替RPV疫苗基因组中的对应基因，可以是单独代替也可以是同时代替，以此构建嵌合体疫苗。研究表明，嵌合体疫苗RPV-PPRFH在组织中繁殖不良，相反的RPV-PPRMFH的繁殖速度得到提升；免疫山羊后，山羊无不良反应，能产生较高的中和抗体，抵抗PPRV强毒的攻击[19]。可见RPV-PPRMFH是一个良好的候选嵌合体疫苗。

2.6 山羊痘活载体疫苗

预防羊痘与小反刍兽疫的疫苗均为弱毒疫苗，存在散毒隐患。重组羊痘病毒（rCPV）免疫后既可以抵抗PPR的感染，同时也能预防CPV的感染。Chen等成功将PPRV的F基因或者H基因插入羊痘病毒的TK基因编码区，构建了重组病毒rCPV-PPRVH及rCPV-PPRVF，研究证实与rCPVPPRVF相比rCPV-PPRVH能产生更强的诱导免疫，免疫注射1次后，就可以使80%的羊产生抗体，免疫6个月后仍能检测到中和抗体[20]。因此，重组羊痘疫苗是小反刍兽疫疫苗新的发展方向。

2.7 RNA干涉技术

通过利用重组腺病毒及杆状病毒载体表达小干扰RNA（SiRNA），用于治疗PPRV及RPV感染，重组病毒可以抑制＞73%的病毒复制，结果表明，SiRNA分子在对抗麻疹病毒感染治疗中具有潜在价值[21]。因此，RNA干涉技术可以克服通常疫苗诱导期长的缺点，有望作为一种有效的抗病毒治疗制剂应用于控制PPRV感染。

3 小结

PCR和c-ELISA检测技术具有快速、特异、灵敏、高通量性的特性，因此成为OIE规定的检测标准方法，而基因工程疫苗将在控制小反刍兽疫中发挥重要的作用。

[1] 印春生,支海兵.小反刍兽疫研究进展[J].中国兽药杂志,2007,41（8）:22-27,38.

[2] Khalafalla A I,Saeed IK,Ali Y H,et al.An outbreak of peste des petits ruminants（PPR）in camels in the Sudan[J].Acta Trop,2010,116（2）:161-165.

[3] 田晓玲.小反刍兽疫基因免疫的研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2009.

[4] Chauhan H C,Lambade P,Sen S,et al.The use of pathological and histopathological techniques in the diagnosis of peste des pe⁃tits ruminants in India[J].Veterinaria Italiana,2011,47（1）:41-47.

[5] 王志亮,包静月,吴晓东,等.我国首例小反刍兽疫诊断报告[J].中国动物检疫,2007,24（8）:24-26.

[6]Osman N A,Ali A S,Rahman M E,et al.Antibody seroprevalenc⁃es against Peste des Petits Ruminants（PPR）virus in sheep and goats in Sudan[J].Tropical animal Health and Production,2009,41（7）:1 449-1 453.

[7] 曲林茂.表达小反刍兽疫病毒H.F蛋白的重组山羊痘病毒的构建及免疫原性研究[D].南京:南京农业大学,2009.

[8] 印春生.小反刍兽疫病毒N蛋白抗原表位多肽的合成及竞争ELISA方法的建立[D].北京:中国兽医药品监察所,2007.

[9] 李刚,江彦增,晁生玉,等.小反刍兽疫快速诊断技术及其疫苗的研究进展[J].中国畜牧兽医,2007,34（5）:81-84.

[10] Saravanan P,Sen A,Balamurugan V,et al.Rapid quality control of a live attenuated Peste des petits ruminants（PPR）vaccine by monoclonal antibody based sandwich ELISA[J].Biologicals,2008,36（1）:1-6.

[11]Zhang G R,Zeng J Y,Zhu Y M,et al.Development of an indirect ELISA with artificially synthesized N protein of PPR virus[J].In⁃tervirerlogy,2012,55（1）:81-84.

[12] Balamuruqan V,Sen A,Venkatesan G,et al.A rapid and sensi⁃tive one stepsybr green based semi quantitative real time RT-PCR for the detection of peste des petits ruminants virus in the clinical samples[J].Virologica Sinica,2012,27（1）:1-9.

[13] Batten C A,Banyard A C,King D P,et al.A real time RT-PCR assay for the specific detection of Peste des petits ruminants virus[J].J Virol Methods,2011,171（2）:401-404.

[14] Saravanan P,Singh R P,Balamuruqan V,et al.Development of a N gene-based PCR-ELISA for detection of Peste-des-petits-ru⁃minants virus in clinical samples[J].Acta Virol,2004,48（4）:249-255.

[15]Walsh E P,Baron M D,Anderson J,et al.Development of a genet⁃ically marked recombinant rinderpest vaccine expressing green fluorescent protein[J].The Gournal of General Virlogy,2000,81（31）:709-718.

[16] Diallo A.Control of peste des petits ruminants:classical and new generation vaccines[J].Developments in Biologicals,2003（114）:113-119.

[17] Rashid A,Hussain A,Asim M.Evaluation of peste des petits ru⁃minants cell culture vaccine in sheep and goats in Pakistan[J].Vet Ital,2010,46（3）:315-318.

[18] Khandelwal A,Renukaradhya G J,Rajasekhar M,et al.Immune responses to hemag-glutinin-neuraminidase protein of peste des⁃petits ruminants virus expressed in transgenic peanut plants in sheep[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2011,140（3-4）:291-296.

[19] Mahapatra M,Parida S,Baron M D,et al.Matrix protein and gly⁃coproteins F and H of Peste-des-petits-ruminants virus function better as a homologous complex[J].The Goural of Gerneral Virolo⁃gy,2006,87（7）:2 021-2 029.

[20] Chen W,Hu S,Qu L,et al.A goat poxvirus-vectored peste-despetits-ruminants vaccine induces long-lasting neutralization anti⁃body to high levels in goats and sheep[J].Vaccine,2010,28（30）:42-50.

[21] Nizamani Z A,Keil G M,Albina E,et al.Potential of adenovirus and baculovirus vectors for the delivery of shRNA against morbil⁃liviruses[J].Antiviral Res,2011,90（1）:98-101.