黄酮类化合物分离纯化技术研究现状

焦月华，朴成玉，严 妍，于 敏，贾博宇，周忠光

（黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，哈尔滨 150040）

黄酮类化合物属于植物的次级代谢产物，在植物内部大部分与糖结合成苷类或以碳糖基的形式存在，多存在于高等植物及羊齿类植物中，现在已发现的8 000多种黄酮类化合物存在于5 000多种植物中[1]。根据苯环间连接位置、氧化程度以及是否成环等将黄酮类化合物分为黄酮和黄酮醇类、二氢黄酮和二氢黄酮醇类、异黄酮和二氢异黄酮类、查尔酮和二氢查尔酮类、橙酮类、花色素和黄烷醇类以及其他黄酮类[2]。

黄酮类化合物具有降低血管脆性及异常的通透性、降血脂、降血压、抑制血小板聚集及血栓形成、抗肝脏病毒、抗炎、抗菌、解栓、抗氧化、清除自由基、抗衰老、抗癌、防癌、降血糖、镇痛和免疫等生理活性[3-6]。这些生理活性已被关注，对该类化合物的研究成为医药界的热门课题。人体自身不能合成黄酮类化合物而只能从食物中摄取，因此多年来科学家都在积极研究探讨从植物体中分离纯度高、活性强的黄酮类化合物[7]。

1 黄酮类化合物的提取

黄酮类化合物在花、叶、果等组织中多以苷元的形式存在，而在根部坚硬组织中，则多以游离苷元形式存在。因此，不同来源、部位、种类黄酮提取所采取的方法不同[7]。分离黄酮类化合物的方法很多，根据黄酮类化合物与混入其他化合物的极性不同可采用溶剂萃取法，根据黄酮化合物在酸性水中难溶、碱性水中易溶的特点可采用碱提酸沉法，根据黄酮类化合物对不同物质的解离性不同可采用离子交换法等。

1.1 溶剂萃取法

溶剂萃取法是目前黄酮类化合物提取最常用的方法之一。其优点是操作过程相对简单，去除杂质效果较好，萃取后澄明度较高。溶剂萃取过程中不仅可以除去杂质还可以起到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果。该方法的缺点是萃取过程中苷类物质及其他有效成分会有部分损失，同时其他一些难溶于水的有效成分还可能在经醇处理后沉淀，所以在处理前应多次试验所用溶剂的种类和浓度。常用的溶剂系统有水-醋酸乙酯、正丁醇-石油醚等。

1.2 微波提取法

微波提取法是将微波与萃取相结合的一种方法。其基本原理是当微波在传输过程中遇到不同的物质，会根据该物质结构不同而产生反射、吸收和穿透现象，因此可以选择性加热待分离基体中欲提取组分所在的区域，从而将其从待分离基体或体系中分离提取，使之进入提取剂[4]。具有回收率高、选择性强、加热快、节约能源、无污染等优点。

1.3 超声波法

超声波提取技术的原理是利用超声的空化作用、热效应和机械作用加速被提取成分的浸出，此外超声波的次级效应（化学效应、搅拌作用、乳化作用）破坏细胞使其加速被提取成分的释放、扩散和溶解。与常规提取法相比，超声波法的优点比较突出，例如能获得较高的产率且无需加热、提取时间短等。

1.4 酶解法

当恰当的酶作用于药用植物材料时，会破坏细胞壁的致密结构，从而减小有效成分从胞内向提取介质扩散时细胞壁与细胞间质等屏障的传质阻力作用。虽然酶解法作用条件温和，也有其局限性：酶有最适温度和最适pH，所以酶解时实验设备应能够较好的控制温度和pH；酶解过程中可能会因为与某些成分发生反应引起结构变化而产生其他化学物质，因此会影响产物的纯度及收率[8]。

1.5 超临界CO2萃取法

超临界CO2萃取是一项萃取新技术，待分离的物质在超临界状态下与超临界流体接触后，根据其极性、沸点和相对分子质量的不同，而依次被萃取、分离出来。超临界CO2萃取法萃取率高且能最大限度保持提取物的天然特征、避免高温、没有有机溶剂残留、生产周期短等诸多优点而越来越受到青睐[9]。但是超临界CO2萃取的极性小，更适宜提取低分子、低极性、亲脂性、低沸点的成分，而在提取相对分子质量较大、极性集团多的成分时需要加入合适的夹带剂来改变原有成分的溶解度。夹带剂往往是具有很好溶解性能的溶剂，例如甲醇、丙酮等。

1.6 半仿生提取技术

半仿生提取法是整体药物研究法与分子药物研究法的整合，该方法模仿口服药在胃肠道中的转运过程，提取含待分离成分高的“活性混合物”，采用选定pH的酸性水和碱性水依次连续提取，因此该方法可以提取和保留更多的有效成分，并能降低成本、缩短生产周期，更适用于一些经消化道给药的中草药制剂。

1.7 超速离心法

超速离心法常作为膜分离法的前处理工艺。工作原理是通过离心机离心加速度在超过重力加速度时能够加速药液中杂质的沉淀从而将其除去。超速离心法的优点是提取后的溶液中有效成分含量高，基本能将药液充分回收，且操作省时、省力、澄明度高等。但该方法仅适用于分离不易沉降的悬浮液却无法除去糖类及其他不易沉降的杂质。

2 黄酮类化合物的分离

经提取的黄酮类化合物仅仅是粗提物，含有其他杂质混合物，而且混合有多种成分的黄酮类化合物，还需进一步分离纯化。常用分离方法有色谱法、硼酸络合法、pH梯度萃取、分子烙印技术等。

2.1 色谱法

2.1.1 柱色谱

柱色谱分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维素粉等。硅胶柱色谱：色谱适用范围广，可用于多种类型的黄酮类化合物的分离；聚酰胺柱色谱：因聚酰胺富含酚羟基，可形成氢键缔合产生吸附，适用于分离苷、苷元、查耳酮与二氢黄酮等各种类型的黄酮类化合物[10]。葡聚糖凝胶：用葡聚糖凝胶分离黄酮苷时，主要起分子筛的作用，在进行洗脱时，黄酮苷类流出柱体的顺序与相对分子质量大小有关，基本上是按照相对分子质量从大到小依次流出；环糊精键合凝胶柱：β环糊精是一种同时具有多羟基外周和疏水空腔的圆筒形分子，黄酮类化合物能够与环糊精配基同时生成氢键并发生疏水作用，从而为色谱分离过程提供保留力，谭天伟等利用环糊精键合凝胶介质分离纯化葛根素、表没食子儿茶素以及槲皮素、山奈酚和异鼠李素，效果良好[11]。大孔树脂吸附性能是由于范德华力或生成氢键的结果，在确定分离条件时，首先要选择树脂的孔径，孔径的选择要参考被分离化合物分子体积的大小，其次要选择树脂的型号和分离条件，这要考虑分子中是否含有羧基、酚羟基或碱性氮原子等官能团。大孔树脂常用的洗脱剂有水、梯度乙醇、甲醇和丙酮等[12]。

2.1.2 加压毛细管电色谱法

加压毛细管电色谱是一种新型微分离分析技术，直流高压电场加压与填充有微细颗粒HPLC填料的毛细管电色谱柱两端，大幅提高了样品分离能力，该方法适用于复杂生物及化学体系的研究[13]。该方法中样品在毛细管柱中的保留行为同时受到电渗流及其在流动相与固定相之间分配系数的双重影响，使分辨能力得到极大提高。Wang等利用加压毛细管电色谱法（pCEC）来测定转基因和非转基因小麦中黄酮类化合物的异同[14]。

2.1.3 薄层色谱

薄层色谱是一种快速、简便、高效、经济、应用广泛的色谱分析方法。常规的薄层色谱法存在展开时间长、展开剂体积需求大和分离结果差等缺点[15]。离心薄层色谱则可以替代制备型薄层色谱，有时甚至能替代柱色谱，分离速度快、处理量大[16]。张超等利用离心薄层色谱成功的从地菍中分离出槲皮素、广寄生苷和山柰酚[17]。

2.1.4 高效制备液相色谱

高效制备液相色谱（HPLC）正相系统的固定相有硅胶柱和氨基柱，反相系统的固定相有C18柱、C8柱、苯基柱、氨基柱及C2柱等[18]。流动相一般用甲醇-水或乙腈-水系统，并加入少量的酸来改善分离效果，防止拖尾[19]。Biesaga等利用RP HPLCUV-MS监测马铃薯成熟过程中某些黄酮类物质含量的变化[20]。但因为其成本比经典柱色谱要高，因此多用于定性与定量分析或者少量物质的纯化。

2.1.5 高速逆流色谱分离法

高速逆流色谱分离法（HSCCC）是一种新的分离技术。其线圈中固定相不需要载体，因而清除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，用于制备性分离时，每次进样体积较大，进样量也较多[9]。Yuan等提取木蝴蝶叶子中黄酮类化合物，经HSCCC分离纯化的效果很好[21]。

2.2 pH梯度萃取

pH梯度萃取法是分离酸性、碱性、两性成分常用的手段。黄酮类化合物由于酚羟基的取代而显酸性，因羟基的数目和位置不同，酸性强弱也不同。pH梯度萃取的原理是由于溶剂系统pH变化改变了其存在状态（游离型或解离型），从而改变了其在溶剂系统中的分配系数。分离酸性强弱不同的黄酮类化合物，可用pH由低至高的碱性缓冲溶液顺次萃取，使酸性由强到弱的黄酮类化合物分别萃取出来。

2.3 分子烙印技术

分子烙印技术是对特定目标分子制备具有高选择识别性能材料的技术[22-23]。分子烙印技术需要首先制作分子烙印聚合物介质，这也是分子烙印技术的关键。通常制作聚合物介质需要3个步骤，首先由聚合物单体溶液与将被分离的目标分子形成复合物，再加入交联剂使复合物产生聚合反应，最后除去包埋在聚合物中的目标分子，就得到分子烙印聚合物介质。该介质对目标分子的结构具有记忆功能，当再次遇到目标分子时，聚合物便可进行选择性识别。按照单体与模板分子间形成复合物的作用力不同，分子烙印技术可分为共价型、非共价型和半共价型[11,16]。

2.4 双水相提取

双水相提取技术优点是两相分相时间短，分相过程温度低，操作简单，提取率高。同时因为PEG及盐类对人体和环境没有毒害，所以双水相提取被称为黄酮化合物富集分离的有效方法之一。石慧等利用PEG400 25%和（NH4）2SO412%组成的双水相体系萃取分离加杨叶中的总黄酮，经过优化，萃取率＞95%，为黄酮类化合物萃取分离的一种有效方法[24]。

2.5 膜分离法

膜分离法是以滤膜为分离介质，以压力为推动力，依靠膜的选择性，将溶液中的混合物分成保留液与通过液两部分，从而按相对分子质量依次将各组分分离、纯化、浓缩。根据孔径不同分为微滤、超滤、纳滤、反渗透等。膜分离是一种物理过程在常温下操作，不需要发生相变化也不需要添加助剂，因而适于分离热敏性、化学性质不稳定的药物[9]。超滤法（UF）介于微滤与纳滤之间，通过控制超滤膜孔径大小，能有效除去提取液中大分子物质，但因目前膜材料的品种较少，膜孔径分布范围较宽而影响了分离性能。

3 结语

提取分离黄酮类化合物的方法很多，而且随着科学技术的发展，不断涌现出很多新方法和新设备，使提取分离效率不断提高。目前在黄酮类化合物的提取方法中，一些传统方法仍占主导地位，但也逐渐暴露出许多问题，如能量消耗大、提取分离周期长、温度要求高、有效成分易被破坏、残留的溶剂污染环境、浪费资源等。一些新兴技术如超滤技术、微波技术等具有能耗小、周期短、产率高、纯度高、有利于保护有效成分不被破坏等特点而日益受到人们关注。黄酮类化合物提取的发展方向应在优化现有传统提取工艺的同时，开发、完善并普及新兴技术。

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