Myo5a末端4个小片段重组质粒的构建

游荷花，沈敬华(山西医科大学汾阳学院病免教研室，汾阳 0300;内蒙古医学院免疫学教研室)

Myo5a，是肌球蛋白的重链12条(MYH12)，染色体定位为:15q21。肌球蛋白为一种马达蛋白，能将化学能转化为机械能，参与包括肌肉收缩、胞质分裂、胞饮作用、趋化性、信号传导及靶向小泡运输等在内的多种细胞活动，在细胞内物质运输中发挥重要作用。肌球蛋白共分为18类(I－XⅧ )，Myo5a属于这个大家族中的第五个家族MyosinⅤ中的一员。最近的实验发现Myo5a可能与一些肿瘤的发生有关［1］。为进一步研究Myo5a与肿瘤的关系，本研究设计构建4个Myo5a末端特异性小片段的原核表达重组质粒PGEX-4T-3/Myo5a，并进行了一系列鉴定，为研究Myo5a的作用提供研究工具。

1 材料与方法

1.1 材料

DNA模板 Myo5a，PGEX-4T-3原核表达载体，DH5α大肠杆菌菌株均为本室保存。T4DNA连接酶，BamHⅠ、XhoⅠ等 DNA限制性内切酶均为Takara公司产品。胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒是AXYGEN公司产品。

1.2 引物的设计与合成

据GenBank的人Myo5a基因全序列，设计了4对引物来扩增Myo5a羧基端4个大小100 bp左右的小片断(见表1)。其中上游引物设计含有BamHⅠ的酶切位点，下游引物设计含有XhoⅠ的酶切位点。4个小片断被分别命名为 down1、down2、down3、down4。

1.3 PCR扩增Myo5a羧基端四个特异性小片断

冰上将 0.5 μl 的 Myo5a DNA 模板，2 μl 的down1 引物，1 μl的 dNTP，0.5 μl的 DNA 聚合酶(Vent酶)，5 μl的缓冲液，41 μl的双蒸水构成 50 μl体系加入PCR管中。先预变性:95℃2 min，然后变性:95℃15 s，后退火50℃30 s，后延伸:72℃45 s，此三步循环30次。最后4℃保温。

扩增down2、down3、down4重复以上操作即可，只是PCR体系中的引物换作对应引物，退火温度down4与down1相同，均为50℃。down2、down3退火温度为54℃。

1.5 %琼脂糖凝胶电泳鉴定被扩增产物。得到所需扩增片段后使用RCR纯化试剂盒提纯DNA。

1.4 目的基因的克隆

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切先前得到的4个PCR产物和PGEX-4T-3质粒载体，胶回收试剂盒纯化酶切后的产物。之后在4℃冰箱用T4 DNA连接酶将4个Myo5a基因小片段与PGEX-4T-3质粒载体按适宜比例相连接过夜。取连接反应液分别转化到大肠杆菌DH 5α感受态细胞，后将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平皿上，37℃培养12－16 h。

1.5 筛选与鉴定重组质粒

1.5.1 PCR鉴定阳性重组质粒 从上述四种LB培养基上每种随机挑取数个菌落，做好标记之后分别接种LB液体培养基中(其中含氨苄青霉素)，剧烈振摇，37℃培养过夜。第2天从各管中分别取菌液以对应引物做PCR反应。经1.5%琼脂糖凝胶电泳作PCR产物鉴定，能扩增出对应Myo5a特异性小基因片段者为阳性重组质粒克隆。

1.5.2 酶切鉴定阳性重组质粒 用质粒小量提取试剂盒对经PCR筛选、鉴定正确的阳性重组质粒克隆提取重组质粒DNA，然后用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，鉴定目的基因是否插入载体中，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 基因序列测定鉴定阳性重组质粒

北京诺塞基因组研究中心有限公司使用双脱氧链终止法全自动测序仪对PCR鉴定及酶切鉴定均正确的重组质粒进行测序。

2 结果

2.1 PCR扩增Myo5a羧基端4个特异性小片断

以人Myo5a基因全序列为模板，用PCR技术扩增出与预期大小一致四对约100 bp左右的DNA片段，结果见图1。

2.2 筛选与鉴定重组质粒

2.2.1 重组质粒的PCR鉴定 对LB平皿上随机挑取的菌落进行PCR扩增鉴定，结果见图2。

2.2.2 重组质粒的酶切鉴定 图3是先选取了PGEX－4T-3/Myo5a-down3重组质粒的4个阳性克隆提取质粒后，4个阳性克隆分别经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定得到了图中2－5泳道中的结果，1泳道为双酶切空载体PGEX-4T-3作对照的结果。1泳道位置略低于重组质粒，且无小片段DNA释放，2－5泳道有150 bp左右DNA小片段释放。图4是其余三种重组质粒也各选取四个阳性克隆经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切的结果。1－4泳道为PGEX-4T-3/Myo5a-down1的双酶切的结果，均有130 bp左右DNA小片段释放。5－8泳道为PGEX-4T-3/Myo5a-down2的双酶切的结果，均有100 bp左右 DNA小片段释放。9－12泳道为PGEX-4T-3/Myo5a-down4的双酶切的结果，最后两泳道有小片段释放。9，10两泳道无小片段释放，说明这两个阳性克隆不正确。

将鉴定正确的重组质粒进行测序，测序结果证明其基因序列与预计的DNA基因序列完全一致。证明down1、down2、down3、down4基因片段已被成功克隆到PGEX-4T-3载体中，即四种重组质粒构建成功。

3 讨论

Myo5a是由头部、颈部、尾部三个功能部位组成，构成一“Y”字形结构。其中尾部较短，颈部较长，而与运输物质有关的是尾部顶端的位点［2］。MyosinⅤ的颈部区域较长，大约24 nm［3］，因而步子比较大。最近研究表明，MyosinⅤ类蛋白在无中间丝的情况下，运动“步伐”会变大、同时速度也会变快，提示中间丝网状结构所形成的黏滞力有可能阻碍了细胞器间的运输［4］。实验证明，提纯的脑肌球蛋白Va在电镜下看到是双头聚合体［5］。研究发现，老鼠肌球蛋白Ⅴ免疫缺陷时表现为皮肤颜色变淡，受影响的老鼠还会出现严重的神经问题，几周后就会死亡，分析认为皮肤颜色变淡是因为黑色素颗粒从黑色素细胞到发光毛发运输的缺损所致［6－8］。这表明肌球蛋白Ⅴ在黑色素运输中是很重要的。也有实验证实人类“Griscelli病”是因为MyosinⅤ基因突变导致了轻色素沉着，共济失调以及各种免疫缺陷和神经系统的症状［9］。因此推断认为肌球蛋白Ⅴ在细胞内主要负责有被小泡和黑色素等微粒的运输，当这种马达发生故障时就会导致神经系统或免疫系统等方面的疾病［10］。近几年又发现Myo5a与一些肿瘤的发生可能有关。

本实验用PCR克隆扩增出4个Myo5a末端基因片段的蛋白编码序列，用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后，将此片段插入原核表达载体pGEX-4T-3，构建重组 子 PGEX-4T-3/Myo5a-down1，PGEX-4T-3/Myo5adown2，PGEX-4T-3/Myo5a-down3，PGEX-4T-3/Myo5adown4。先后用PCR、限制性酶切和基因测序来证实得到的是我们所需的重组质粒，为后续研究Myo5a的作用提供研究工具，从而可以深入研究非常规肌球蛋白在肿瘤细胞转移中的作用及其调控分子机制。

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