心衰大鼠β3AR自身抗体的产生与心肌重塑的关系

姚 红，郭海秀，刘慧荣

(1山西医科大学微生物学与免疫学教研室，太原 030001;2山西医科大学生理学教研室;3首都医科大学病理生理学教研室;*通讯作者，E-mail:liuhr2000@126.com)

心力衰竭(简称心衰，HF)是多种心血管疾病发展到严重或终末阶段的病理生理状态，是全球范围内造成死亡的重要原因［1］。近20余年间，心衰患者体内陆续发现了抗 β1/β2肾上腺素受体(β1/β2-AR)抗体、抗肌球蛋白抗体、抗M2胆碱能受体抗体等一系列抗心肌自身抗体，他们对心肌造成损害作用的研究亦在逐步深入。新近本研究小组证实，心衰患者体内还存在β3肾上腺素受体自身抗体，且其具有受体激动剂样效应，可影响心肌细胞的生物效应［2，3］。这些证据强烈提示，自身免疫损伤可能在心衰发生发展过程中起着重要作用。但有关心肌自身抗体的产生机制却鲜见报道。

心肌重塑被认为是心衰发生机制中的分子细胞学基础。随着心衰发展过程中心肌重塑不断加重，推测心肌细胞抗原数量及分布位置可能发生改变，从而促进自身抗体的产生。本研究通过腹主动脉缩窄法制备心力衰竭大鼠模型，分析大鼠外周血β3AR自身抗体和心肌β3AR表达水平，探讨心衰发生发展过程中β3AR自身抗体的产生和心肌重塑的关系，以期为心衰发病过程中自身抗体的产生机制提供试验证据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

纯种健康雄性Wistar大鼠(由山西医科大学动物中心提供)，10周龄，体重 200－250 g，按随机数字表随机分为2组:①心衰模型组(HF组，n=80):实施腹主动脉缩窄术;②伪手术对照组(sham组，n=40):仅分离腹主动脉而不结扎缩窄，其他操作与心衰模型组相同。

1.2 主要仪器和试剂

全波长扫描型酶标仪(美国Molecular Devices公司);RM6240 B型多道生理记录仪(四川成都仪器厂);β3AR抗原肽段由西安美联生物工程公司合成;大鼠β3AR特异性抗体购自Santa Cruz公司。

1.3 主要方法

1.3.1 慢性心力衰竭模型的建立 10%水合氯醛(400 mg/kg体重)腹腔麻醉，常规备皮消毒，逐层打开腹腔，左侧肾动脉上方游离腹主动脉长约1 cm，与腹主动脉平行放置7号钝针头，将两者一同结扎，肾出现缺血外观，抽出针头，使腹主动脉部分缩窄，狭窄处内径约0.7 mm。大鼠在30℃条件下苏醒。伪手术组仅开腹分离腹主动脉，穿线不结扎。

1.3.2 大鼠血流动力学指标检测和心脏标本分析

分别于手术后4，8，12和16周随机选取实验大鼠(HF组n=8，sham组n=6)称量体重后，用25%乌拉坦麻醉，经右侧颈总动脉插入心导管至左心室，记录左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室内压最大收缩率(+d p/d tmax)和最大舒张率(－d p/d tmax)。测定结束后，迅速取出心脏，沿冠状面将心脏分为两部分，一部分置于10%中性福尔马林固定48 h，常规脱水，石蜡包埋，制作4μm组织切片，采用Masson和HE染色于光学显微镜下观察心肌形态;一部分低温保存，用于心肌细胞β3AR测定。

1.3.3 心肌细胞β3AR含量测定 采用蛋白免疫印迹技术(Western blot)测定大鼠左心室组织β3AR含量。心肌组织蛋白提取按照膜相/水相蛋白提取试剂盒(TansMem protein isolation system instructions，Applygen Technologies Inc)说明书操作。蛋白含量采用BCA法测定。30μg变性蛋白经10%SDS-PAGE凝胶分离后转膜，分别与大鼠β3AR特异性抗体及二抗孵育，采用化学发光法测定结果。

1.3.4 大鼠血清中β3AR自身抗体的测定 分别于术前及手术后4周，8周，12周和16周采用剪尾法收集大鼠血液，2 500 r/min离心，分离血清，应用ELISA方法检测 β3AR自身抗体［4］。主要步骤如下:以1μg/ml人工合成β3AR细胞外第二环肽段作为包被抗原，按每孔50μl包被96孔ELISA板，5%小牛血清的磷酸盐缓冲液封板;将待测血清以1∶10稀释于PMT溶液中，以每孔50μl加于 ELISA板，37℃水浴1 h，弃去上清，PBS-T溶液洗板三次，每次间隔5 min，空干;将生物素化山羊抗大鼠IgG(Sigma)按1∶3 000稀释于PMT溶液中，以每孔50 μl加于ELISA板，37℃水浴1 h，弃去上清，PBS-T溶液洗板三次，每次间隔5 min，空干;将标记有辣根过氧化物酶的链霉亲和素SA-HRP(Sigma)以1∶4 000的浓度稀释于PMT溶液中，以每孔50μl加于ELISA板，37℃水浴1 h，弃去上清，PBS-T溶液洗板三次，每次间隔5 min，空干;将新鲜配制的底物ABTS(2 mmol/L)与H2O2(2.5 mmol/L)的混合液以每孔50μl加于ELISA板，37℃水浴30 min;利用酶标仪波长λ=405 nm读取各孔的光密度值(optical density，OD)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠血流动力学指标变化

实施腹主动脉狭窄术后8周，HF组大鼠的LVSP和±d p/d t max均低于sham组，LVEDP高于伪手术组，差异具有统计学意义(P＜0.05);术后12和16周，心功能障碍无进一步加重的趋势，但与同期伪手术组相比，各参数仍有明显的差异(P＜0.05，见表1)。提示心衰大鼠模型建立成功。

2.2 大鼠心肌形态学改变

Masson和HE染色结合光学显微镜观察及图像分析技术显示，HF组大鼠随着时间的推移，心肌发生了多病灶的变性病变，伴有淋巴细胞浸润;心肌组织发生明显的胶原纤维化(图1，见第165页)。

2.3 心衰模型形成过程中，心肌细胞β3 AR的含量改变

与同期sham组大鼠相比，HF组大鼠心肌细胞β3AR含量在术后4周已有轻微增加，但差异尚无统计学意义(P＞0.05);在术后8，12 和16周，β3AR的含量一直维持在较高的水平，与同期sham组差异具有统计学意义(P＜0.05，见图2)。

2.4 大鼠血清中β3AR自身抗体的产生和变化规律

术后4周，HF组大鼠血清中β3AR自身抗体水平(A值)较同期sham组增高(P＜0.05);术后8周时上升达峰值，保持至12周。术后16周，HF组大鼠血清中β3AR自身抗体下降，较同期sham组差异无统计学意义(P＞0.05，见图3)。

3 讨论

β肾上腺素受体(βAR)是交感神经系统的重要成员，在调节心脏活动中发挥着重要的作用。以前认为，心脏仅表达β1AR和β2AR两种亚型，发挥心肌正性变时、变力和变传导效应。最近的研究发现，在人类等多种种属动物的心肌细胞中也有β3AR的表达，介导心肌负性变力效应。Moniotte等［5］发现，心衰患者心肌β3AR表达水平较正常人上调2－3倍，而且与之偶联的Gi蛋白也上调。起搏引发的狗心脏衰竭［6］及异丙肾上腺素诱导的大鼠心衰模型［7］也发现了心肌β3AR上调。本研究采用腹主动脉缩窄增大左心负荷的方式成功建立大鼠心力衰竭模型，大鼠在手术处理8周之后，LVEDP升高，±d p/dtmax显著下降，出现心肌细胞肥大、心肌纤维化等心肌重塑表现，同时证实心衰大鼠心肌β3AR的表达明显增高，并在心衰发展过程中持续处于高水平表达。提示心衰时β3AR的激活可能在心脏活动的调节中发挥着重要作用，并且推测心衰时心肌重塑，心肌细胞β3AR抗原数量的改变，可能会激活自身反应性淋巴细胞，促发相应自身抗体的产生。

本研究进一步采用人工合成β3AR细胞外第二环肽段作为包被抗原，运用ELISA技术检测发现，心衰大鼠血清中出现了高滴度的β3AR自身抗体。在心衰过程中随着心脏病理变化的发展，该抗体呈现一种产生、增强、维持和自然消退的自我消长变化规律，也就是说，在没有任何附加干扰因素条件下，单纯心力衰竭的病理变化就能引发β3AR自身抗体的产生。分析β3AR自身抗体和心肌β3AR表达的变化规律发现，在术后4周大鼠心肌β3AR含量开始升高时，血清中β3AR自身抗体亦出现较高的滴度;在术后8周后心肌β3AR含量达高峰并持续高含量表达时，血清中相应自身抗体的含量也达到高峰，并保持了一定的时程;但在术后16周时，尽管心衰大鼠心肌β3AR依旧高表达，但其血清中β3AR自身抗体已经回落，甚至消失。此结果提示，心衰发生时心肌重塑β3AR表达增高可能是促进β3AR自身抗体产生的因素之一，但在心衰发展过程中还有其他因素参与了抗β3AR自身抗体的调节，值得我们进一步研究。

［1］Rosamond W，Flegal K，Furie K，etal.Heart disease and stroke statistics-2008 update:a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee［J］.Circulation，2008，117(4):e25－e146.

［2］姚红，郝素珍，赵荣瑞，等.不同原发疾病所致心衰患者中β3－肾上腺素受体自身抗体的检测意义［J］.中国预防医学杂志，2008，9(10):875－878.

［3］李美霞，王晓樑，汤嘉宁，等.心力衰竭患者抗β3肾上腺素能受体自身抗体的分布及特性［J］.中华心血管病杂志，2005，33(12):1114－1118.

［4］姚红，李强，武烨，等.心力衰竭发展过程中β3肾上腺素受体自身抗体的产生及意义［J］.中国药物与临床，2011，11(5):492－496.

［5］Moniotte S，Balligand J.Potential use of beta(3)-adrenoceptor antagonists in heart failure therapy［J］.Cardiovasc Drug Rev，2002，20(1):19－26.

［6］Morimoto A，Hasegawa H，Cheng H，etal.Endogenous beta3-adrenoreceptor activation contributes to left ventricular and cardiomyocyte dysfunction in heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，286(6):H2425－H2433.

［7］Zhang Z，Cheng H，Onishi K，etal.Enhanced inhibition of L-type Ca2+current by beta3-adrenergic stimulation in failing rat heart［J］.JPharmacol Exp Ther，2005，315(3):1203－1211.