不同组织化学染色在急性心肌缺血猝死鉴定中的应用研究

陈 冰，陈 阳，闫宜峰，陶香香，何 雷(皖南医学院病理教研室，芜湖 400;皖南医学院法医学系;弋矶山医院病理科)

心源性猝死一直是法医学死因判定上的难点，而急性心肌缺血猝死心肌的病理组织学诊断是法医工作者诊断心源性猝死的关键所在。现代病理学技术的发展，为急性心肌缺血猝死心肌的病理组织学诊断提供了较为客观的检查方法和观察指标。HE染色在心肌缺血6－12 h后发现病变，已被大多数学者认可，但这些病理变化的特异性还有待进一步探索。特殊组织学染色是一种比较实用的诊断心肌缺血的方法，可以作为常规技术广泛应用于法医实践工作中，Nagar-Olsen染色(苏木精碱性复红苦味酸法)、Heidenhain染色(铁矾-苏木素－伊红染色)，文献报道都可用在心肌缺血的早期诊断中。刘英坤等［1］研究报道Heidenhain染色方法可在早期缺血的心肌纤维出现明显的反应，胡志红等［2］进一步验证和揭示了Heidenhain染色方法的应用价值，也有部分学者采用Nagar-Olsen染色进行心肌缺血的早期诊断［3］。Heidenhain氏苏木精法染色在操作流程中有别于Heidenhain染色，且用于心肌缺血的早期诊断鲜见报道。

为了探讨准确的组织学染色方法对法医检案实践中的诊断及鉴别的帮助作用，进一步确定Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精法染色在急性心肌缺血猝死鉴定中的应用价值，本文采用HE染色、Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色(铁矾－苏木素－伊红染色)和Heidenhain氏苏木精法染色对28例急性心肌梗死心肌、10例冠心病非心源性猝死心肌进行染色，并设10例正常心肌对照组作比较性研究，以便寻找到简易可行，结果可靠的染色方法。

1 材料和方法

1.1 材料

所有标本均选自我院法医鉴定中心2009－2012年来受理的法医病理学检验案例。死者年龄20－65岁。根据尸体解剖及HE染色结果，并结合法医鉴定书，分为3组:①28例急性心肌梗死组，冠状动脉狭窄均为Ⅲ－Ⅳ级，HE染色可见心肌梗死，经全面尸检排除其他死因。②10例冠心病非心源性猝死组，冠状动脉狭窄为Ⅰ－Ⅳ级，肉眼及HE染色均未见心肌梗死病灶。③10例对照组，生前均无心脏病史，解剖也未发现有心脏器质性病变，死因为颅脑外伤或机械性损伤。

1.2 染色方法

1.2.1 HE染色 常规脱水，浸蜡，包埋、石蜡切片脱蜡至水;苏木素染色;分化;伊红染色;脱水、透明、封片。

1.2.2 Nagar-Olsen染色 ①石蜡切片脱蜡至水;②浸入Nagar-Olsen氏苏木精溶液10－20 s;③流水冲洗5 min;④0.1%碱性复红水溶液3 min;⑤蒸馏水洗5－10 s;⑥纯丙酮5－10 s;⑦0.1%苦味酸－丙酮溶液分化至无色，约20 s;⑧二甲苯透明，树胶封固。

1.2.3 Heidenhain染色(铁矾－ 苏木素－ 伊红染色) ①石蜡切片脱蜡至水;②媒染于5%铁矾液内5－7 min，水洗30 s;③苏木素液中染5－7 min，流水冲洗5 s;在铁矾液中分色(镜下控制到正常心肌纤维为无色为止)，流水冲洗5 min;⑤各级乙醇脱水至95%乙醇时，酸溶液伊红复染;⑥脱水、透明、树胶封片。

1.2.4 Heidenhain氏苏木精法染色 ①石蜡切片脱蜡至水;②5%硫酸铁铵水溶液中媒染60 min;③蒸馏水急洗5－10 s;④放入Heidenhain氏苏木精溶液内60 min;⑤以5%硫酸铁铵水溶液与蒸馏水1∶1稀释分化并流水冲洗交替进行(镜下控制);⑥流水冲洗10 min;⑦脱水、透明、树胶封片。

1.3 判定标准

三种组织化学染色方法结果判定标准见表1。

HE染色结果判定标准:正常心肌纤维染色为粉红色，胞质、胞核显示清晰，细胞膜完整，细胞排列规则，细胞间隙适中。

1.4 统计学分析

应用SPSS 19.0软件包进行分析，各组间阳性率比较采用χ2检验。各种方法比较采用秩和检验。

2 结果

2.1 HE 染色结果

对48例标本均进行了HE染色，对照组心肌纤维染色为粉红色，胞质胞核及组织结构清晰;急性心肌梗死组梗死区心肌纤维凝固性坏死、核碎裂、消失，胞质均呈不规则粗颗粒状，间质水肿，有少量中性粒细胞浸润(图1)，冠状动脉Ⅲ－Ⅳ级狭窄，部分区域可见钙化灶(图2);冠心病非心源性猝死组，心肌纤维染色为粉红色，胞质胞核及组织结构清晰，冠状动脉Ⅰ－Ⅳ级狭窄，均未见梗死灶。HE染色显示只有在梗死区才会出现细胞核的改变，在非梗死区心肌纤维表现为细胞水肿，胞质红染，胞核无明显病变，与对照组心肌很难鉴别。

2.2 Nagar-Olsen 染色结果

Nagar-Olsen染色显示对照组心肌呈浅棕色，无艳红的缺氧心肌存在(图3);急性心肌梗死组在梗死区周围可见心肌呈艳红色，呈灶状或片状分布(图4);非心源性猝死组大部分心肌呈浅棕色，其中有2例在边缘区出现艳红色。

2.3 Heidenhain 染色结果

Heidenhain染色显示对照组心肌呈红色，无黑色的缺氧心肌存在;急性心肌梗死组梗死区大部分心肌纤维胞质内出现黑点，呈灶状或片状分布(图5);非心源性猝死组有1例在心外膜下心肌纤维胞质内出现黑点，呈点状分布。

2.4 Heidenhain氏苏木精法染色结果

Heidenhain氏苏木精法染色显示，对照组心肌呈棕黄色，心肌纤维胞质内未见黑点;急性心肌梗死组，梗死区大部分心肌纤维胞质内出现黑点，呈灶状或片状分布(图6)，胞核也呈黑色;非心源性猝死组也有1例在心外膜下心肌纤维胞质内出现了黑点。

2.5 不同染色方法在各组表达的结果

表2结果显示Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精染色在急性心肌梗死心肌组中阳性表达率分别为75%，54%和50%;在冠心病非心源性猝死心肌中阳性表达率分别为20%，10%和10%;在正常心肌组表达均呈阴性。上述三种方法在以上两组的阳性表达率比较未见统计学差异(P＞0.05)，但急性心肌梗死心肌组与非心源性猝死组及对照组阳性表达率比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

猝死(sudden death)是由于机体潜在的疾病或重要器官急性功能障碍导致的意外突然的死亡。由于猝死发生时的意外性和突然性，且多无医生在场，易引起怀疑，故需经法医解剖鉴定死因［4］。据我国猝死资料统计分析，心血管疾病猝死大约占50%－60%，居猝死发生率之首［5］。其中冠心病是心血管系统疾病中发生猝死最常见的疾病。对于冠心病猝死的法医学鉴定，特别要注意寻找心肌缺血性改变，尤其要注意寻找早期心肌缺血的改变。所以，判定早期的心肌缺血，对心源性猝死的法医学鉴定具有重大的实际意义。

虽然急性心源性猝死的早期病理改变常规组织病理学检查有时难以发现明显的形态学改变，但我们对各组均进行了HE染色，旨在确定梗死区的范围和观察梗区边缘心肌缺血的病理变化。同时观察到细胞核的改变主要出现在明显的梗死区内，而在非梗死区心肌纤维的表现在三组中无明显差别。因此HE染色在观察早期心肌缺血方面应以胞质的变化为主。

寻找更敏感的染色方法，并用于法医实践中，对鉴别和诊断早期心肌缺血具有重要的意义。特殊染色具有价格便宜、操作简便易行、结果准确、灵敏等优点，不失为一种有价值的诊断早期缺血的方法，心肌早期缺血改变与正常心肌对某些色素的着色性质不同而呈现不同的色调，因而可以显示和判定心肌早期缺血的变化。目前，主要常用于心肌缺血诊断的组织学染色方法有Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色等［6］。而Heidenhain氏苏木精染色也是一种传统的染色方法，通常是用于一些较薄的组织的回染。特别是用于细胞核的染色观察，能够清楚地显示染色体、染色质以及细胞质中线粒体的位置。此外，还可以使髓鞘染色，用于心肌早期缺血判定鲜见报道。

目前对于这些方法的研究，文献表明主要是采用其中的一种与HE染色进行比较，而且往往是用于动物实验［7］。因此本研究对上述三种染色方法进行了比较性研究，本研究发现，与HE染色比较，在部分HE显示相对正常的区域，Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精染色都提示有缺氧的心肌的存在;而且急性心肌梗死组与非心源性猝死组及对照组阳性表达率比较差异有统计学意义(P＜0.01)，证实了这三种染色方法在急性心源性猝死的诊断上都具有应用价值。

研究还显示Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精染色虽然方法不同，操作步骤不一样，但结果基本一致(P＞0.05)，且在急性心肌梗死组中，Heidenhain氏苏木精染色强阳性率为50%(14/28)，显著高于Heidenhain染色的强阳性率18%(5/28)。文献中大多采用的是 Heidenhain染色［8］。其中 Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精染色经过我们反复实验，表明在早期缺氧心肌中显示为细胞质中出现黑点，病变的部位主要在心内膜下(血管供应末端)、心肌细胞膜及横纹处(功能代谢强)，并未出现文献报道的心肌染为黑色［2］。同时，Nagar-Olsen染色的阳性率(75%)较高，该染色方法较其他两种方法在操作分化时较容易控制有关，但强阳性数不足，可能与Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精染色中的苏木素液与其配制方法不同有关。Nagar-Olsen染色在梗死区周围的心肌显示为明显的艳红色并大致勾勒出坏死的边缘，有助于确定梗死区的范围及面积。

研究结果显示，单独使用 Nagar-Olsen染色、Heidenhain染色、Heidenhain氏苏木精染色法在显现早期心肌缺血方面有可能出现假阳性或假阴性(若对操作流程中的技术不熟练，分化掌握不好时易出现)。因此，我们建议采用HE染色结合Nagar-Olsen染色方法，避免出现假阳性或假阴性，并且有助于确定梗死区的范围及面积;或采用HE染色结合Heidenhain氏苏木精法染色，强阳性率较高，有助于急性心源性猝死诊断的准确性。

免疫组化虽也能发现早期的心肌缺血性改变，但是该方法试剂价格昂贵，实验条件要求较高，操作技术性强，不宜在基层广泛开展。而组织化学染色，实验试剂价格低廉、易操作，只要严格按操作步骤操作，避免假阳性的发生，在基层宜推广。因此，在心肌早期缺血法医学鉴定过程中，采用HE染色结合Nagar-Olsen染色或HE染色结合Heidenhain氏苏木精法进行检测具有重要的实用价值。

［1］ 刘英坤，钟志，班翔，等.诊断早期心肌缺血三种组织学染色方法的比较［J］.哈尔滨医科大学学报，2002，36(3):238.

［2］ 胡志红，王庭，吴萍.心肌Heidenhain染色在冠心病猝死诊断中的应用观察［J］.九江学院学报，2011，92(1):46－47.

［3］ 李建宇，李怡，龚海英，等.蕨麻正丁醇提取部位对小鼠急性心肌缺血损伤的保护作用［J］.中西医结合学报，2009，7(1):48－52.

［4］ 邵同先，张苏亚.不同组化染色对实验性急性心肌缺血的早期诊断研究［J］.陕西医学杂志，2005，34(4):443－445.

［5］ 张海娥，贺卫东.116例尸体解剖的临床病理分析［J］.中国临床医学，2004，11(6):1111－1114.

［6］ 孟祥艳，孙慧燕，孔麟麟，等.锌指基因ZFP580在大鼠心肌缺血损伤中的表达［J］.武警医学院学报，2010，19(1):1－3.

［7］ 张新宁，吕琪，张永亮.大鼠心肌缺血再灌注模型建立方法的改进［J］.武警医学院学报，2008，17(11):941－942.

［8］ 李凡，马淑玲，莫耀南，等.心肌特殊染色在冠心病猝死诊断中的应用研究［J］.河南科技大学学报:医学版，2003，21(4):264.