旋转式生物反应器内构建组织工程椎间盘

张文捷，张 亮，赵春明，张 威 (江苏省泰州市人民医院骨科，江苏 泰州 225300)

椎间盘退变性病变现阶段临床常常会使用到的治疗方法是保守或是手术融合相关节段，但是都会不同程度地忽略椎间盘功能的重建。生物反应器能模拟体内生物环境，是组织工程的理想培养系统。笔者探讨旋转式生物反应器(RCCS)对体外构建的组织工程髓核的影响。

1 材料与方法

1.1 材料:新西兰兔(南京金陵种兔场)，培养基DMEM/F－12 (美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、多聚赖氨酸、抗坏血酸(美Sigma公司)，Ⅱ型胶原多克隆抗体SABC、DAB试剂盒(武汉博士德公司)，PLGA无纺网支架(上海易括公司)，旋转式生物反应器(美国Synthecon公司)。

1.2 方法

1.2.1 髓核细胞的分离:无菌条件下取出1个月新西兰兔髓核组织，将其剪成1mm大小，经0.25%胰酶消化后加胎牛血清中和，离心去上清，PBS洗涤。加入0.2%的Ⅱ型胶原酶消化4 h，滤液经1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗再次离心，白色沉淀中加入含15%胎牛血清的DMEM/F－12培养基，调整细胞密度，以5×104/ml密度接种于培养瓶中培养。每2～3天换液1次，当细胞80%融合后，胰酶消化传代，取第3代细胞备用。

1.2.2 细胞接种支架及实验分组:PLGA无纺网支架材料，将支架切成5 mm×5mm大小，浸入10 g/L多聚赖氨酸中，完全浸透后取出，自然干燥后，无菌PBS冲洗3遍，放入90mm无菌培养皿中干燥，环氧乙烷消毒后备用。取第3代髓核细胞，调整细胞浓度为3×107/ml，每个支架中滴加40μl细胞悬液，置于6孔培养板内，放入细胞培养箱内培养。培养72 h后，进行实验分组。实验分两组:6块髓核细胞与支架复合物为治疗组，移入RCCS内，调整转速至细胞与支架复合物处于半悬浮状态，约20 r/min，以后随着复合物的变化调整转速。另6块髓核细胞与支架复合物为对照组，在六孔板内静态培养。两组均隔天换液1次。

1.2.3 大体标本和组织学观察:4周后将复合物顺利取出，对组织工程髓核的形态、大小、厚度和弹性所发生的变化进行详细的观察;组织学观察:标本行HE染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色(SABC法DAB显色)，用Image Proplus软件对Ⅱ胶原免疫组化染色切片行半定量图像分析。

2 结果

2.1 大体标本观察:治疗组形成的髓核组织表面光滑，体积较大，厚度较厚，呈伞型，具有一定弹性及抗压能力。对照组髓核组织表面欠光整，体积较小，厚度薄，弹性差，见图1～2。

2.2 HE染色组织学观察:HE染色发现，治疗组细胞数目较多，均匀连续分布，组织具有一定的排列结构。对照组细胞数目少，细胞间排列稀疏，分布不均匀，组织排列紊乱。

2.3 免疫组织化学观察:治疗组与对照组免疫组织化学结果比较表明，治疗组染色程度深，染色面积大。治疗组阳性染色面积为(15.0±4.6)%，对照组为(6.5±2.2)%，两组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

椎间盘退变将引起其他一系列脊柱退行性疾病，理想的治疗方案是重建椎间盘的组织功能。组织工程学的发展，为治疗椎间盘退变引入了新的方法［1］。

椎间盘在体内处于复杂的应力环境，具有良好的生物力学强度对于其维持正常功能具有重要意义。椎间盘组织的力学强度主要由其细胞外基质所维持，髓核细胞主要表达Ⅱ型胶原及蛋白多糖，Ⅱ型胶原承受压力，蛋白多糖承受张力。常规体外条件下构建的组织工程椎间盘只能达到外形上的相似，在细胞外基质上难以达到正常椎间盘组织的要求［2］。分析其原因，可能为在普通培养中细胞承受重力、减切力等不利影响，难以模拟体内所处的失重环境，支架中心的细胞营养物质的缺乏，从而影响细胞增殖及细胞外基质合成。

生物反应器的发展为组织工程带来新的希望，目前在骨及软骨组织工程中生物反应器已有较广泛应用，通过其构建的组织更接近于活体。本实验所采用的旋转式生物反应器，能为构建的组织工程髓核提供了低剪切力及微重力的有利环境。本实验中通过调整转速至细胞与支架复合物处于半悬浮状态，约20 r/min，使得细胞与支架复合体作为一个整体相互间无相对运动，他们不与容器壁或任何其他易致损伤的物体相碰，剪切力趋于零，细胞不易受到机械损伤，易于保持活性，有利于细胞在支架上均匀分布，促进营养成分和氧气运送至支架中心，保证支架中央细胞的代谢需要，使得培养组织不易形成“坏死中心”，从而促进细胞增殖及基质分泌。

本研究表明，旋转式生物反应器能够提供低剪切力及微重力的培养环境，能促进髓核细胞增殖和细胞外基质分泌，为解决普通条件下的组织工程髓核中细胞外基质成分少的难题提供了可能，为组织工程髓核应用于临床创造了有利条件。

［1］ Mehrkens A，Muller AM，Valderrabano V，etal.Tissue engineering approaches to degenerative disc disease－ameta－analysis of controlled animal trials［J］.Osteoarthritis Cartilage，2012，20(11):1316.

［2］ 张 亮，任永信，葛 灵，张 宁.离心应力下构建组织工程髓核［J］.南京医科大学学报(自然科学版)，2008，28(06):707.