冷冻胚胎经序贯共培养用于建立人胚胎干细胞系

李 娟 张艳萍 张丽红 盖 凌 邱 毅 魏 斌 王洪岩 吴爱华 王磊光

山东省计划生育科学技术研究所，山东省优生技术重点实验室(济南，250002)

人胚胎干细胞(hESC)是一种源于人囊胚内细胞团(ICM)，经体外分离、培养获得的原始全能干细胞。自1998年人类首次利用体外受精胚胎建立ESC 系后［1，2］，各国科学家相继建立了约 120 株hESC。hESC系的建立不仅可用于体外研究人类胚胎的发生发育过程，而且可通过定向分化诱导产生各种特化的细胞和组织，用于治疗多种临床疾病。在hESC建系和维持过程中，胚胎材料来源、ICM分离、扩增传代等均为难点。本研究拟利用体外受精-胚胎移植过程中冷冻10年以上的卵裂期胚胎，探讨经体外序贯共培养至囊胚期，建立hESC系的方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

序贯培养液(IVC，美国)，丝裂霉素C、L-谷氨酰胺(Sigma，美国)，胎牛血清(四季青，杭州)，Knockout DMEM培养基、胰酶、非必需氨基酸、二巯基乙醇(Gibco，美国)，白血病抑制因子(LIF，Chemicon，美国)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，RD，美国)，碱性磷酸酶(AKP)试剂盒(碧云天生物技术研究所，江苏)、八聚体结合转录因子(Oct-4)试剂盒(博奥森生物技术有限公司，北京)。解剖显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜(Nikon，日本)，CO2培养箱(Galaxy，英国)。

1.2 方法

1.2.1 人卵裂期胚胎 长期冷冻的卵裂期胚胎由山东省计划生育科学技术研究所生殖中心提供，经伦理委员会讨论通过，并经接受助孕且已生育健康子女夫妇知情同意。共收集13枚冷冻卵裂期胚胎。

1.2.2 人卵丘细胞共培养体系的制备及胚胎序贯共培养 人卵丘细胞取自因男方因素不育需做卵胞浆内单精子注射的女性患者，取卵后获得的卵-冠-丘复合体用80U/ml透明质酸酶分离卵子和卵丘细胞，收集卵子用于卵胞浆内单精子注射;卵丘细胞迅速收集在离心管中，加卵裂期序贯培养液4～6ml混匀，1 000rpm/min离心5min，弃上清，沉淀加序贯培养液调密度为5×104/ml，制成50μl/滴的人卵丘细胞液滴，置入37℃、CO2培养箱培养，当卵丘细胞贴壁伸展后，更换序贯培养液，用于解冻后胚胎共培养。常规解冻胚胎，放入制备好的单层卵丘细胞饲养层共培养，2～8细胞期胚胎用卵裂期培养液，8细胞后更换囊胚培养液，培养至囊胚期。

1.2.3 饲养层和条件培养基的制备 取孕13.5d昆明小鼠胚胎，去除头、四肢及内脏，眼科剪剪躯干部分成约1mm3组织块，0.25%胰蛋白酶室温消化3～5min后，成纤维细胞培养液终止消化，轻轻吹打混匀，收集胎鼠成纤维细胞(MEF)并接种在培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞铺满80%皿底时，即可进行传代。第2～3代MEF铺满80%皿底时，用含10μg/ml丝裂霉素C的培养基培养2～3h，常规胰酶消化，并种植单细胞悬液到预先用明胶处理过的培养皿中，细胞贴壁伸展后，用于ESC培养。条件培养基的制备:取2代MEF饲养细胞，以5×104/ml密度种植于75cm2培养瓶中，加入ESC培养液，置37℃、5%CO2培养箱中培养;3d后取上清，5 000rpm/min离心10min;取上清分装，4℃保存备用。

1.2.4 全胚培养法分离囊胚ICM 囊胚经机械辅助孵出，直接接种于制备好的 MEF饲养层上，置37℃，5%CO2培养箱培养，移入前1～3h MEF饲养层更换ESC培养液;逐日观察，每天半量换液，胚胎1～2d开始贴壁，继续培养5～6d后每天换含20%MEF条件培养基的ESC培养液，7～10d后，部分ICM逐渐隆起致密，呈克隆样生长。

1.2.5 干细胞培养 ICM呈明显克隆样生长时，玻璃针挑出ICM，机械分割后，接种于含新饲养层细胞的培养皿中置37℃，5%CO2培养箱继续培养，离散的hESC培养1 d左右细胞开始贴壁;2d后待其充分贴壁后每天半量更换培养液;继续培养4～6d后，见岛丘状或鸟巢状ESC样集落出现并明显增大，选择折光性增强、形态典型、周围没有分化迹象、生长旺盛的ESC集落，机械分割成小块，每块约含干细胞100～300个左右，重新接种传代，并常规对hESC进行玻璃化冷冻。

1.2.6 hESC的鉴定 ①生物学特性观察:倒置显微镜下观察胚胎生长和hESC集落的形态特征及生长状态;②AKP组织化学染色鉴定:按AKP试剂盒说明操作，镜下观察AKP染色紫蓝色为阳性，AKP染色呈成淡黄色或无色为阴性;③Oct-4免疫荧光染色;④染色体检查。

1.2.7 ESC体外诱导分化 选取传10代以上生长旺盛、形态典型的ESC集落，机械分割成小团，毛细玻璃管吸取并放在预先制备好的培养皿盖上，加不含LIF的ESC培养液滴，翻转皿盖使液滴悬挂在盖子上，置37℃ ，5%CO2培养箱中悬浮培养，定时观察，隔天半量换液。

2 结果

2.1 胚胎体外序贯共培养和干细胞分离与培养结果

13枚卵裂期胚胎复苏，9枚存活，其中Ⅱ级胚胎4枚，Ⅲ级胚胎5枚，经序贯共培养3～5d，有6枚发育至囊胚期(图1)，机械辅助孵出后移入制备好的MEF饲养层上培养;7～15d后，3枚ICM有明显隆起形成原代克隆(图2)，采用机械法传代培养，2枚传至2～3代后分化，1枚成功建系传至10代以上。建系的hESC集落呈典型鸟巢状生长，集落内细胞界限清楚、核大、核仁清晰、细胞核/细胞质比例高，集落周边与MEF饲养层界限清楚，无分化迹象(图3、4)。

2.2 hESC的AKP组织化学染色鉴定

镜下观察hESC集落呈AKP阳性，紫蓝色着色;MEF呈阴性，淡黄色着色或无色(图5)。

2.3 Oct-4免疫荧光染色鉴定与染色体检查

免疫荧光染色检测阳性表达hESC特异性转录因子Oct4(图6)，将传至第10代以上的ESC用胰酶消化形成单细胞悬液，采用常规G显带法分析细胞染色体核型，核型为46，XY(图7)。

2.4 hESC体外分化能力的鉴定

hESC经过6～10d的悬浮培养，形成拟胚体(EBs)，贴壁培养后发现EBs外向性生长，周围分化的细胞形态呈多样性;培养22d后形成心肌样细胞，有自发搏动。

3 讨论

hESC是了解人胚胎发育机制和实现治疗性克隆的前提，hESC的体外分离培养受多种因素影响。时至目前，hESC来源引发的伦理问题以及ICM分离、扩增传代、冻存复苏等技术难点依然限制hESC大量体外扩增、培养及进行相关研究。经体外受精后发育至囊胚阶段的优质胚胎是hESC成功建系的最佳选择，但由于受国家法律和伦理学的限制，不能获取足够的优质胚胎，本研究利用体外受精-胚胎移植后长期保存的冷冻胚胎，经体外序贯共培养，改善胚胎体外培养环境，促进胚胎体外发育［3］;结合辅助孵出技术，采用全胚培养从6枚囊胚中分离到3枚完整ICM原代克隆，并最终获得1个干细胞系，建系率 16.67% ，与已报道的建系率［4，5］相近。

从囊胚中分离ICM是hESC建系的第一步，也是最关键一步［6］，常用的ICM主要分离方法包括全胚培养法与免疫外科法。本研究对囊胚期胚胎采用机械辅助孵出后全胚培养，并在随后的原代培养中适时加入含20%MEF条件培养基的干细胞培养液，避免了MEF饲养层因老化而分泌不足，有助于ICM增殖，待ICM呈柱状突起且扩张迅速时，机械挑取ICM用于干细胞建系。此法操作简便易行，并且对细胞的损伤较小，能最大限度地保留ICM活力，有助于hESC成功建系［7］。但通过全胚培养法分离ICM获得的hES易混杂滋养层细胞，需要经过传代筛选的过程才能获得较纯hESC系，再者由于受滋养层细胞的干扰易导致ICM分化。

ICM的离散时机也非常重要。传代时间太早或太晚都易导致分化，无法获得hESC。本研究在胚胎种植后增殖培养7～15d时，一旦发现ICM隆起致密且呈柱状生长时，挑取ICM易获得典型的hESC样克隆集落，与文献［8，9］报道一致。

本研究为保持干细胞纯化采用机械法传代［10］。建系初期选择机械法传代，可有选择地去除混杂的滋养层细胞及分化细胞，纯化hESC系;在后续培养中，机械法能有选择地对未分化集落进行直观操作，能长期维持hESC的正常核型，避免酶消化法导致的细胞死亡，并避免长期酶消化传代所导致的染色体变异及分化。有研究认为酶在ESC传代时可能会通过影响ESC的体外自我更新信号通路，导致其分化［11］。但机械法传代不同于酶消化法传代，需要在相对开放的环境下进行，对操作者技术及操作环境有着非常严格的要求，以有效维持无菌环境和无菌培养体系，而且随着传代增多工作量会大幅度提高。怎样选择更有效的传代方法，还有待于进一步探讨。

我国人口分布面广，人群遗传背景差异显著，急需建立更多的细胞系来满足未来的研究和应用。hESC培养体系存在培养环境要求较高、技术环节多、操作难度大、易污染等问题，而且其自我更新和多向分化潜能的机制有待进一步研究，因此建立完善有效的hESC培养体系尤为重要。本研究初步尝试利用长期冷冻的废弃胚胎采用卵丘细胞序贯共培养改善胚胎体外培养条件，提高胚胎体外发育潜力，有利于建立hESC系，从而为后续的研究工作提供材料平台。

1 Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts［J］.Science，1998，282(5391):1145-1147.

2 Shamblott MJ，Axelman J，Wang S，et al.Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells［J］.Proc Natl Acad Sci，1998，95(23):1326-1331.

3 李娟，盖凌，魏斌，等.3种体细胞共培养体系对昆明鼠早期胚胎体外发育潜力的影响研究［J］.中国计划生育学杂志，2012，20(7):455-458.

4 Peng HM，Chen GA.Serum-free medium cultivation to improve efficacy in establishment of human embryonic stem cell lines［J］.Hum Reprod，2006，21(1):217-222.

5 Venu P，Chakraborty S，Inamdar MS.Analysis of long-term culture properties and pluripotent character of two sibling human embryonic stem cell lines derived from discarded embryos［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2010，46(3-4):200-205.

6 Zhou D，Lin G，Xie CQ，et al.Establishment and maintenance of three Chinese human embryonic stem cell lines［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2010，46(3-4):192-199.

7 Heins N，Englund MC，sjöblom C，et al.Derivation，characterization，and differentiation of human embryonic stem cells［J］.Stem Cells，2004，22:367-376.

8 Wang F，Kong HJ，Kan QC，et al.Analysis of blastocyst culture of discarded embryos and its significance for establishing human embryonic stem cell lines［J］.J Cell Biochem，2012，113(12):3835-3842.

9 Li PF，Wang F，Kong HJ，et al.Establishment of polycystic ovary syndrome-derived human embryonic stem cell lines［J］.Gynecol Endocrinol，2012，28(1):25-28.

10 Oh SK，Kim HS，Park YB，et al.Methods for expansion of human embryonic stem cells［J］.Stem Cells，2005，23:605-609.

11 Hirai H，Karian P，Kikyo N.Regulation of embryonic stem cellself-renewal and pluripotency by leukaemia inhibitory factor［J］.Biochem J，2011，438(1):11-23.