骨桥蛋白和CD44v6在口腔鳞状细胞癌中的表达及其意义

张晋弘，许彦枝，张玲玲，刘月平，刘 健*

（1.河北医科大学第一医院口腔科，河北石家庄050031；2.河北医科大学第四医院口腔科，河北石家庄050011；3.河北医科大学第四医院病理科，河北石家庄050011）

·论 著·

骨桥蛋白和CD44v6在口腔鳞状细胞癌中的表达及其意义

张晋弘1，许彦枝2，张玲玲3，刘月平3，刘 健2*

（1.河北医科大学第一医院口腔科，河北石家庄050031；2.河北医科大学第四医院口腔科，河北石家庄050011；3.河北医科大学第四医院病理科，河北石家庄050011）

目的 探讨骨桥蛋白（osteopontin，OPN）和黏附分子CD44拼构变异体6（homing cell adhesion molecule variant6，CD44v6）在口腔鳞状细胞癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法检测OPN和CD44v6蛋白在口腔鳞状细胞癌组织中的表达，分析其表达与患者临床病理学资料之间的关系。结果OPN和CD44v6在口腔鳞状细胞癌中阳性表达率分别为64.3％、61.2％，均明显高于在癌旁正常口腔黏膜中的表达（P＜0.01）。OPN和CD44v6组织分化Ⅲ级的阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ级，淋巴结转移组阳性率明显高于淋巴结未转移组，差异有统计学意义（P＜0.05），但与性别、年龄无关。结论OPN和CD44v6与口腔鳞状细胞癌的分化程度和淋巴结转移关系密切，在其进展过程中起着重要的作用；而OPN与CD44v6的关系有待进一步研究。

口腔肿瘤；骨桥蛋白质；免疫组织化学

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部恶性肿瘤中最常见病理学类型，5年生存率约为50％，其浸润和转移是影响预后的主要因素，因而早期发现、预防肿瘤的转移和复发是改善患者预后的重要因素。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，首先发现于骨基质中。近年来，OPN与肿瘤发生发展的关系日益受到关注。OPN通过特有的与细胞黏附相关的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列与其受体整合素、CD44等结合来促进细胞的趋化、黏附、迁移和增殖，从而介导肿瘤细胞的侵袭转移［1］。目前研究［2］显示，细胞黏附分子CD44的表达与人类多种癌症的转移有关，其中其变体CD44v6与恶性肿瘤转移的关系最为密切。本研究采用免疫组织化学SP法检测OSCC中OPN及CD44v6蛋白的表达情况，探讨其与病理特征之间的关系，旨在为判断预后、指导临床治疗及预防患者复发提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取河北医科大学第四医院病理科2005年1月—2010年12月手术切除的原发性OSCC中性福尔马林固定石蜡包埋组织98例。所有患者术前均未接受过放化疗。其中男性51例，女性47例，年龄34～76岁，平均59.18岁；组织分化Ⅰ～Ⅱ级24例，Ⅲ级74例；淋巴结转移57例，无转移41例。选取30例癌旁组织（证实2cm外无肿瘤）及非肿瘤患者的正常组织。蜡块4μm连续切片，其中一张切片常规HE染色，其余切片用于免疫组织化学染色。

1.2 免疫组织化学检测：主要试剂包括OPN单克隆抗体（鼠抗人，AKm2A1）为美国Santa Cruz公司开发产品；CD44v6单克隆抗体（鼠抗人，VEF-7）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。采用SP免疫组织化学染色法常规10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续4μm厚切片。经二甲苯和梯度乙醇脱蜡、水化，高压煮沸修复抗原；滴加一抗，置于4℃冰箱过夜；依次滴加生物素化山羊抗小鼠IgG及试剂，DAB显色；苏木素复染后水洗，依次酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，最后显微镜下观察。分别用1.5％正常兔血清和0.01mol/L PBS液取代第一抗体作为替代对照和空白对照，用已知阳性片为阳性对照。

1.3 结果判定：阳性结果判断标准为，光镜下观察、综合分析整张切片阳性细胞所占的比例和染色强度。OPN蛋白的阳性定位在胞浆，阳性表现为瘤细胞胞浆内出现清晰可见的、定位准确的淡黄色至棕黄色颗粒。CD44v6的阳性定位在胞膜，阳性表现为瘤细胞胞膜出现清晰可见的、定位准确的淡黄色至棕黄色颗粒。

以染色强度和阳性细胞率的得分之和进行综合评价，无染色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞占肿瘤细胞的百分比为阳性细胞率，阳性细胞率≤5％记0分，＞5％～25％记1分，＞25％～50％记2分，＞50％记3分。将上述2项积分相加，0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中等强度阳性（++），5～6分为强阳性（+++）。按照OPN及CD44v6蛋白表达程度为阳性组（++～+++）和阴性组（-～+）。

1.4 统计学方法：应用SPSS13.0软件包进行数据处理，计数资料以百分率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CD44v6和OPN在OSCC及正常组织中的表达：98例OSCC中OPN的阳性率为64.3％，显著高于在癌旁及正常组织中表达的16.7％，CD44v6的阳性率为61.2％，显著高于在癌旁及正常组织中的表达10.0％，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1，图1～3。

2.2 CD44v6和OPN表达与临床病理学资料的关系：CD44v6和OPN在组织分化Ⅲ级的阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ级，淋巴结转移组阳性率明显高于淋巴结未转移组，差异均有统计学意义（P＜0.05），但与性别、年龄无关。见表2。

表1 CD44v6、OPN在OSCC及正常组织中的表达Table1 CD44v6 and OPN expression in OSCC and pericancerous tissues （n）

表2 CD44v6、OPN在OSCC中的表达及其与临床病理资料的关系Table 2 Relationship between the expression of CD44v6，OPN and the clinicopathological factors in OSCC （n）

3 讨 论

人类OPN基因位于染色体4 q21～q25，包括7个外显子和314个氨基酸残基，其中含有如钙结合域、凝血酶裂解位点及整合素RGD结合序列等多个功能结合区，在细胞的黏附与迁移、组织修复、细胞的信号转导中发挥重要的作用［3］。最初的研究主要集中在骨骼和肾脏疾病中。随着研究深入，人们发现OPN与肿瘤的关系很密切，在结肠癌［4］、卵巢癌［5］及头颈部肿瘤［6］等原发肿瘤及其转移瘤组织中高表达，并且在膀胱癌的研究中发现血清和组织OPN高表达的患者复发率呈增高趋势，表明OPN可能在肿瘤发生及侵袭转移中具有重要作用［7］。

CD44是通过细胞表面的跨膜糖蛋白介导细胞黏附作用，其中含有外显因子v6的CD44变异体（CD44v6）与肿瘤的关系较密切［8］，且有学者认为其阳性表达率与OSCC转移能力呈正相关关系［9］。

本研究结果显示，组织分化越差OPN及CD44v6表达越高，淋巴结转移组阳性率也明显高于无淋巴结转移组（P＜0.05）。提示OPN及CD44v6可能参与OSCC的侵袭和转移。

Duterme等［10］认为在许多细胞如成纤维细胞和巨噬细胞等细胞外膜，胞内OPN与CD44、ERM（ezrin/radixin/moesin）蛋白形成复合体。Rao等［11］研究显示OPN和CD44v6表达呈一致性，这与本研究结果相似，CD44v6表达可能随OPN表达增加而上调。推测OPN可能通过与受体CD44v6结合来促进细胞的趋化、黏附和迁移而介导肿瘤细胞的迁徙转移，在恶性肿瘤的转移和复发中发挥重要作用。因此，临床上有望通过联合检测OPN和CD44v6表达预测OSCC患者的预后，为OSCC患者的预后判断和临床治疗提供理论依据。（本文图见封二）

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（本文编辑：刘斯静）

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF OSTEOPONTIN AND CD44v6 IN ORAL SQUAMOUSCELL CARCINOMA

ZHANG Jinhong1，XU Yanzhi2，ZHANG Lingling3，LIU Yueping3，LIU Jian2*（1.Department of Stomatology，the First Hospital of HebeiMedical University，Hebei Province，Shijiazhuang 050031，China；2.Department of Stomatology，Hebei Province Shijiazhuang 050011，China；3.Department of
Pathology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Hebei Province Shijiazhuang 050011，China）

Objective To investigate the expression of osteopontin（OPN）and CD44v6 and their relationship with clinical pathological characteristics in oral squamous cell carcinoma（OSCC）.MethodsThe expression of OPN and CD44v6 proteins in oral squamous cell carcinoma were detected by SP immunohistochemical method.According to the clinical information，all data were analyzed by SPSS13.0 for windows to explore the relationship between the two indexes and the pathological features.ResultsThe positive rates of OPN and CD44v6 in oral squamous cell carcinoma were respectively 64.3％and 61.2％，which were significantly higher compared with those of adjacent non-tumor tissues and normal oralmembrane tissues（P＜0.01）.The positive rate expression of OPN and CD44v6 of poor differentiation group were significantly higher than those of well differentiation group and moderation differentiation group（P＜0.05）.The metastasis of lymph node，the expression levels of OPN and CD44v6 in lymph nodemetastasis group were significantly higher than those of non lymph nodemetastasis group（P＜0.05），however，no significant difference existed in gender and age.ConclusionThe

mouth neoplasms；osteopontin；immunohistochemistry

R739.8

A

1007-3205（2013）07-0745-04

2013-04-01；

2013-05-08

河北省卫生厅科研基金项目（20100281）

张晋弘（1975-），男，河北石家庄人，河北医科大学第一医院主治医师，医学硕士，从事口腔颌面外科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：zjh888fff@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.001

expression of OPN and CD44v6 are closely related with the differentiation degree，lymphatic node metastasis of oral squamous cell carcinoma，and they play important roles in the development of oral squamous cell carcinoma，and the relationship between OPN and CD44v6 gen needs further studies.