蛞蝓胶囊大鼠长期毒性实验研究

周永恒 ，夏承来 ，段才闻 ，严鹏科 *，谢金魁 *(.广州医学院第三附属医院药学部，广州 5050；.南华大学药理研究所，湖南 衡阳 4000)

蛞蝓(Limax)是一种危害农作物有肺的软体动物，属腹足类腹足纲蛞蝓科，我国各地有产。蛞蝓药用在汉朝的《神农本草经》就已记载，此后《本草纲目》、《中药大辞典》等均对蛞蝓有详细论述。蛞蝓有清热解毒、活血祛瘀、软坚散结等功能，常用于治疗咳、喘、痰呜、咽喉肿痛、半身不遂等症，近年研究主要在肺癌、肺气肿、支气管炎、支气管哮喘等方面。殷志等[1]研究证实蛞蝓提取物LE对人肺癌A549细胞有生长抑制作用；谢金魁等[2]研究提出蛞蝓提取物EL-3抗肺癌的作用机制是多靶点复合性的；本研究组[3]研究证实蛞蝓对实验性肺气肿合并肺动脉高压具有较好治疗作用，蛞蝓冻干粉对急性支气管炎有较强的镇咳和祛痰作用[4]；国外研究者仅利用蛞蝓作为嗅觉和味觉神经调控的动物模型来研究[5]。本试验受试物蛞蝓胶囊是以广西百色地区足襞蛞蝓为原料制备的匀浆冻干制剂，按《药品注册管理办法》注册分类，属中药2类新药。目前国内外未见有蛞蝓胶囊长期毒性研究的文献报道，本试验旨在按《中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则》[6]和《药物非临床研究质量管理规范》开展蛞蝓胶囊对大鼠的长期毒性研究，探讨蛞蝓胶囊重复用药的长期毒性，为后期的临床研究提供实验依据。

1 材料

1.1 药物

蛞蝓胶囊(南华大学药物药理研究所研制，批号：20101015)，临床应用途径为口服，预期人临床剂量 11.0 mg·kg-1·d-1，推荐临床用药时间为60 d。实验时取胶囊内容物蛞蝓冻干粉用 0.9%生理盐水配制成溶液供灌胃使用。

1.2 动物

SD大鼠，清洁级，♀♂各半，体质量(75.0±8.6)g，来源于湖南农业大学动物科技学院实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK(湘)2003-0003。

1.3 仪器与试剂

BECKMAN全自动生化分析仪(德国BECKMAN公司)；日立7110型血细胞分析仪(日本日立)；FA1004型电子天平(上海天平仪器厂)；1512型组织切片机(德国来卡公司)；OLYMPUSCH显微镜摄影系统(日本OLYMPUS公司)。

血细胞检测稀释液(中科院中生公司，批号：1002016)；血液生化检测试剂分别为：血糖、总蛋白、总胆固醇、丙氨酸氨基转换酶、天门冬氨酸氨基转换酶、肌酐、尿素氮(北京中生生物工程高技术公司产品，批号分别为：100202，100401，100125，100213，100217，100201，100201)。

2 方法

2.1 剂量设定

预期人临床剂量 11.0 mg·kg-1·d-1，按标准动物的等效剂量折算系数法计算出大鼠剂量为 70.0 mg·kg-1·d-1[7]。大鼠长期毒性试验原则上低剂量大于等效剂量或者最低有效剂量，高剂量一般为低剂量的10倍左右，中剂量为高、低剂量的对数中位数[8]，计算出低、中、高剂量(175.0，553.0，1 750.0 mg·kg-1)。

2.2 动物分组、给药、饲养与抽样

取SD大鼠160只，♀♂各半，将动物适应环境饲养2周，均衡随机分成4组，每组40只。4组大鼠分别给 0.9%生理盐水(对照组)，蛞蝓胶囊175.0，553.0，1 750.0 mg·kg-1，给药容积均为 10.0 mL·kg-1；每日上午 9∶00~10∶00 定时 1 次灌胃给药，每周给药6 d，连续给药26周，并停药观察4周。每周根据大鼠体质量变化调整给药量。动物在清洁级动物室中饲养，喂全价颗粒饲料，饮冷开水；实验室温度19~24 ℃，湿度50%~70%。于第13周给药后夜间禁食，自由饮水。次日每组取♀♂各5只测各项指标；试验结束时(26周)每组取♀♂各10只测各项指标；恢复期观察1个月(4周)，每组取剩余动物测各项指标。

2.3 检测指标

①一般观察指标。给药期间，每日观察动物存活、外观、行为、活动、毛色、精神状态、呼吸、粪便情况；每周称实验动物体重 1次；每周称剩余饲料并计算平均每日每只大鼠进食量。②血液学、生化学和尿常规检测。分别于给药第 13周、26周和恢复期4周后，进行血液学指标[红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白计数及分类、淋巴细胞(LYM)、中性粒细胞(GRAN)、单核细胞(MID，含单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞及其他白细胞前体)、血小板(PLT)、出凝血时间(CT、PT)]、生化学指标[谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(UREA)、总胆固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)、血糖(GLU)、肌酸激酶(CK)，钾(K)]和尿液分析(尿胆原、胆红素、酮体、隐血、蛋白质、葡萄糖、pH、亚硝酸盐、红细胞、白细胞)。③解剖学、病理学检查，分别于第13周、第26周、恢复期4周，处死各组部分动物进行系统解剖学和病理组织学检查。

2.4 统计学分析

体质量、摄食量、血液学、血清生化学指标和脏器系数均为计量资料，用±s 表示，根据方差分析结果，各组之间进行t检验。用SPSS 16.0统计软件，比较给药组与对照组均数的统计学差异。

3 结果

3.1 对大鼠一般状况、行为活动及死亡的影响

试验期间各组与对照组比较，各给药组在给药26周和恢复期4周的观察中，外观、行为、活动毛色、精神状态、呼吸、粪便的性状等均无明显改变。对照组、给药各组在给药前、给药 1~26周、恢复期4周内均无动物死亡。

3.2 对大鼠体质量的影响

试验期间各组动物体质量均有增长，与对照组比较，各给药组在给药26周和恢复期4周期间大鼠体质量均无明显影响，给药组与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

3.3 对大鼠进食量的影响

与对照组比较，各给药组在给药期和恢复期期间大鼠进食量均无明显影响，给药组与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

3.4 对一般血液学指标的影响

与对照组比较，各给药组在实验中期、实验末期和停药恢复期 4周期间，各项血液学指标(RBC、WBC，血红蛋白计数及分类，LYM，GRAN，MID，PLT，CT、PT)差异无统计学意义(P 均>0.05)。

3.5 对大鼠血液生化指标的影响

与对照组比较，各给药组在实验中期、实验末期和停药恢复期4周期间，各项生化指标(ALT，AST，TP，BUN，UREA，CHOL，TG，GLU，CK，K)差异无统计学意义(P均>0.05)。

3.6 对大鼠尿液的影响

与对照组比较，各给药组在实验前、实验中期、实验末期和停药恢复期 4周期间，大鼠尿液各项指标(尿胆原、胆红素、酮体、隐血、蛋白质、葡萄糖、pH、亚硝酸盐、红细胞、白细胞)差异无统计学意义(P>0.05)。

3.7 对大鼠脏器系数的影响

于实验中期、实验结束时、停药恢复期观察4周后，处死各组部分动物进行系统解剖检查发现：各组动物发育良好，口、鼻、眼、耳未见异常分泌物，各脏器(脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢)肉眼未见明显形态学改变。给药组与对照组比较，各脏器系数差异无统计学意义(P>0.05)。

3.8 对大鼠脏器病理组织学的影响

在给药的第13、26周和恢复期4周，取动物脏器用 10%甲醛溶液固定，其中对照组和高剂量组器官予石腊包埋，常规切片、HE染色，用OLYMPUS-CH显微镜摄影系统进行病理组织学检查。肉眼观察，组织表面与切面均未见异常改变。脑、垂体、脊髓、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、食管、唾液腺、胃、小肠、大肠、肝、胰腺、肾、肾上腺、脾、心、气管、肺、主动脉、睾丸、附睾、前列腺、子宫、乳腺、卵巢、膀胱、坐骨神经、视神经、骨髓、淋巴结等实质性脏器给药组与对照组比较无明显差异，未见急性和慢性中毒性损伤样病理改变。

4 讨论

长期毒性试验是药物非临床安全性评价的核心内容，是药物从药学研究进入临床试验的重要环节。本试验通过大鼠重复给药表征蛞蝓胶囊的毒性作用，预测其可能对人体产生的不良反应，降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险。实验结果蛞蝓胶囊按低剂量 175.0 mg·kg-1、中剂量 553.0 mg·kg-1、高剂量 1 750.0 mg·kg-1给大鼠连续灌胃给药 26周，停药恢复 4周，给药组与对照组比较，大鼠的外观体征、腺体分泌、呼吸、粪便、饲料的日消耗量、给药局部反应等均未见异常。给药组体质量增长正常，血常规及血液生化检查，与对照组比较差异均无统计学意义。主要脏器的病理组织学检查，未见因药物毒性引起的明显病理改变。结果提示：蛞蝓胶囊对大鼠灌胃给药的安全剂量是 1 750.0 mg·kg-1。

本次实验的高剂量 1 750.0 mg·kg-1按千克体质量折算相当于70 kg成人临床用药剂量159倍，一般认为，按体质量计算，大鼠1 d内最大给药量相当于成人临床日用剂量的 100倍以上是较安全的[9]。综上所述，蛞蝓胶囊对大鼠长期反复用药无明显的毒性作用，可预测临床剂量以 11.0 mg·kg-1·d-1，连续用药为 60 d，是比较安全的。

[1]YIN Z, ZHUANG Y Z, CAO J G, et al. Inhibition effect of Limax extract in growth of A549 cell line and tumorigenicity in mice [J]. J Nanhua Univ(Med Ed)(南华大学学报 医学版),2009, 37(1): 45-47.

[2]XIE J K, CAO J G, ZHANG A Q, et al. Research of EL-3 on anti-lung cancer mechanism [J]. J Tradit Chin Med Univ Hunan(湖南中医药大学学报), 2011, 31(7): 6-10, 17.

[3]YU J, YAN P K, ZHANG S J, et al. Therapeutic effect of Slug capsule on experimental emphysema complicated with pulmonary artery hypertension in hamsters [J]. Chin J New Drugs Clin Rem(中国新药与临床杂), 2009, 28(9): 667-670.

[4]LIN G Q, YAN P K, LUO Q F, et al. Therapeutic effect of Lyophilizing Slug powder on acute bronchitis in mice [J].Guide China Med(中国医药指南), 2011, 9(21): 248-250.

[5]WATANABE S, INOUE T, MURAKAMI M, et a1.Modulation of oscillatory neural activities by cholinergic activation of interneurons in the olfactory center of a terrestrial slug [J]. Brain Res, 2001, 896(1/2): 30-35.

[6]State Food and Drug Administration. The guide of studying to the new traditional Chinese drug(中药新药研究指南)[S].2004: 123.

[7]XU S Y. Experimental Methodology of Pharmacology(药理实验方法学)[M]. Beijing: People's Medical Publishing House,2002: 203.

[8]State Food and Drug Administration. The Guiding Principle of Investigative Techniques on Drugs(药物研究技术指导原则)[M]. Beijing: Chinese Science and Technology on Medicine Publishing House, 2007: 20-25.

[9]CHEN Q. Research Methods in Pharmacology of Chinese Materia Medica(中药药理研究方法学)[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 1994: 112.