光度法测定小麦粉中过氧化苯甲酰研究

田林双 于 伟 吴存兵 顾鹏程 周琳琨 邱 琳

（江苏财经职业技术学院1，淮安 223003）

（江苏省淮安市科技局2，淮安 223001）

过氧化苯甲酰（简称BPO）曾作为小麦粉的改良剂和增白剂［1］，在我国批准使用多年。鉴于BPO对小麦粉营养和人体健康产生的危害［2］，2011年2月，卫生部等七部门联合发文，禁止在小麦粉生产中添加BPO，但仍有小麦粉生产者或经营者为了追求小麦粉白度，达到以次充好目的，在小麦粉中违法添加BPO。

小麦粉中BPO含量的检测，主要有氧化还原滴定法［3－4］、可见分光光度法［5－7］、荧光分光光度法［2］、气相色谱法［8－9］、高效液相色谱法［10－12］、化学发光法［13－14］和生物传感器法［15］。上述检测方法各有特点，亦存在部分不足。氧化还原滴定法只适用于高含量组分测定；荧光分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法和化学发光法分析时间长，需要价格昂贵的分析仪器，不便于现场检测；生物传感器法中所需要的生物传感器制作过程复杂；可见分光光度法仪器价格低、测定结果准确、分析速度快、适用于现场检测。目前发表的BPO可见分光光度法基于的检测原理，主要有碘 －淀粉光度法［5－6］和铁（Ⅱ）－邻菲啰啉褪色光度法［7］。碘－淀粉光度法中，BPO的提取溶剂乙醇会影响碘－淀粉的显色，降低了方法的灵敏度［6］。铁（Ⅱ）－邻菲啰啉褪色光度法的线性较差（R2＜0.94），线性范围小［7］。本研究基于BPO的氧化性，将 Fe2＋氧化成 Fe3＋，生成的 Fe3＋与硫氰酸盐在酸性乙醇介质中发生显色，建立一种BPO检测新方法，以期实现BPO的快速、准确、经济和现场检测，进而有效控制BPO在小麦粉中的违法添加。

1 材料与方法

1.1 S材料与试剂

小麦粉样品（市售）：江苏淮安。

无水乙醇、BPO、KSCN、（NH4）2Fe（SO4）2·6H2O、（NH4）Fe（SO4）2·12H2O、HCl（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

UV5100分光光度计：天津港东科技发展股份有限公司；HH－8恒温水浴锅：常州国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 光谱吸收曲线

取4支比色管，试验组1和试验组2加入BPO乙醇溶液，使BPO在比色管中的终浓度分别为5 mg／L和10 mg／L。试验组3和试验组4加入（NH4）Fe（SO4）2·12H2O标准溶液，使 Fe3＋终浓度分别为3 mg／L和 6 mg／L。各 试 验 组 均 加 入 （NH4）2Fe（SO4）2·6H2O、KSCN和稀盐酸标准溶液，使 Fe2＋、KSCN和HCl在各比色管中的终质量浓度分别为10mg／L、3 g／L和 1 mmol／L。控制反应介质中含乙醇96%。Fe2＋质量浓度为10 mg／L、KSCN质量浓度为3 g／L、HCl浓度为 1 mmol／L的乙醇溶液为参比溶液。各比色管置于60℃水浴环境下反应10 min，取出，450～550 nm之间进行光谱扫描。

1.3.2 反应介质对光谱吸收曲线的影响

在试验组和对照组比色管中分别加入适量（NH4）2Fe（SO4）2·12H2O溶液、KSCN溶液和 HCl溶液，使各比色管中 Fe2＋终质量浓度为10 mg／L，KSCN终质量浓度为 3 g／L，HCl终浓度为 1 mmol／L。在试验组比色管中加入BPO乙醇溶液，使BPO终质量浓度为4 mg／L。对照组比色管不加入BPO乙醇溶液。设定试验组和对照组比色管乙醇终体积分数分别为 60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、98%。将各比色管置于60℃水浴环境下反应10 min，取出，分别用对应对照组溶液调零，450～550 nm之间进行光谱扫描。

1.3.3 酸含量对显色反应影响

配置BPO标准乙醇溶液，质量浓度为10 mg／L。配置KSCN标准水溶液，质量浓度为300 g／L。配置不同浓度（NH4）2Fe（SO4）2·12H2O和 HCl混合水溶液，Fe2＋质量浓度固定为 1 000 mg／L，HCl浓度分别为 0、1、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 mmol／L。取5 mL比色管，加入BPO标准乙醇溶液2 mL，KSCN标准水溶液 50μL，不同浓度（NH4）2Fe（SO4）2·12H2O和HCl混合水溶液50μL，无水乙醇定容至5 mL。最终，各试验组比色管中，BPO、Fe2＋、KSCN终质量浓度分别为4 mg／L，10 mg／L和3 g／L，乙醇体积分数为98%，HCl终浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 mmol／L。将各比色管置于60℃水浴环境下反应10 min，取出，分别用对应对照组溶液调零，505 nm下测定吸光度。

1.3.4显色反应温度对显色反应影响

各比色管中，HCl终浓度为 2 mmol／L，BPO、Fe2＋、KSCN终质量浓度分别为4 mg／L，10 mg／L和3 g／L，乙醇体积分数为 98%，溶液配制方法参照1.3.3。将比色管分别置于 20、30、40、50、60、70、80、90、100℃水浴环境下反应10 min，取出，按照1.3.3方法测定吸光度。

1.3.5 显色反应时间对显色反应影响

比色管中各组分浓度同1.3.4，将各比色管置于50℃水浴环境下，分别反应 0、2、5、10、15、20、30、60 min。取出，按照1.3.3方法测定吸光度。

1.3.6 反应介质中Fe2＋浓度对显色反应影响

各比色管中，Fe2＋终质量浓度分别为 0、1、2、4、6、10、15、20、30、50 mg／L。其余组分浓度同 1.3.4。将比色管置于50℃水浴环境下反应15 min，取出，按照1.3.3方法测定吸光度。

1.3.7 反应介质中KSCN质量浓度对显色反应影响

各比色管中，Fe2＋质量终浓度为 15 mg／L，KSCN终质量浓度分别为 0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5、3、6、10 g／L。其余组分浓度同1.3.4，按照1.3.3方法测定吸光度。

1.3.8 标准曲线

分别配置 0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、15 mg／L的BPO无水乙醇标准溶液，按照最佳试验条件，用空白试剂做参比，测定各溶液吸光度，绘制标准曲线。

1.3.9 小麦粉中BPO的提取

定量称取0.1～1.0 g小麦粉于表面皿中，干燥器常温干燥12 h后，倒入25 mL离心管中，加入无水乙醇10 mL，超声提取5 min，离心，获得上清液5 mL，按照最佳试验条件，测定BPO含量。

1.3.10 共存物质干扰

向反应体系中，分别加入 Na＋、K＋、Sr2＋、Ag＋、Mg2＋、NH4＋、Ba2＋、Cl－、NO3－、Mo（V）和 W（V）标准溶液，控制反应体系中，乙醇体积分数98%，BPO、HCl、Fe2＋、KSCN浓度分别为 2 mg／L、2 mmol／L、15 mg／L和3 g／L。按照1.3.8方法，测定BPO含量。

1.3.11 样品分析

取6份市售小麦粉样品，按照1.3.9方法，提取小麦粉中BPO，按照最佳试验条件，进行样品分析及回收率试验。

1.4 数据处理

采用EXCEL 2003及SPSS 13.0对试验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 光谱吸收曲线

光谱吸收试验结果（图1）表明，4个试验组光谱吸收曲线走向相似，说明存在于试验组1和试验组2中的 BPO，的确能够氧化 Fe2＋成 Fe3＋，Fe3＋再与KSCN发生显色反应。试验组1与试验组2较，BPO质量浓度为10 mg／L的试验组2吸光度大于BPO质量浓度为5 mg／L的试验组1吸光度，提示若建立吸光度与BPO浓度的定量关系，则可以通过检测显色反应产物的方法间接测定BPO。

图1 400～600 nm之间各试验组光谱吸收曲线

2.2 反应介质对光谱吸收曲线影响

本研究预试验结果表明，反应介质中，乙醇的含量影响有色配合物的显色行为，有必要设计试验，研究不同乙醇含量对显色反应的影响。试验结果（图2）表明，反应介质中乙醇含量极大的影响配合物的显色，乙醇含量越高，实验组比色管内溶液颜色越深，吸光度越大。张东等［6］在研究碘－淀粉光度法测定BPO时，同样发现乙醇含量影响碘－淀粉配合物的显色，所不同的是碘－淀粉光度法，高含量的乙醇降低BPO检测的灵敏度。而本研究中，高含量的乙醇提高了BPO检测的灵敏度。

本研究确定乙醇最佳体积分数为98%，之所以不研究更高的乙醇含量对光谱吸收曲线的影响，是因为反应体系中Fe2＋、KSCN和HCl标准溶液的加入，会带入少量的水。

图2 反应介质中乙醇含量对配合物光谱吸收曲线的影响

2.3 酸含量对显色反应影响

根据2.1，2.2试验结果，研究在98%乙醇作为反应介质、测量波长为505 nm的条件下，反应介质中酸含量对显色反应的影响。试验结果（图3）表明，当反应介质中 HCl浓度从0.2 mmol／L增加到2 mmol／L，吸光度随着酸浓度的增加而增加。当反应体系中酸浓度大于5 mmol／L时，对照组和试验组比色管均出现浑浊，推测原因是高浓度的酸影响了KSCN或Fe2＋在反应体系中的溶解，因此确定HCl最佳浓度为 2 mmol／L。

图3 反应介质中酸浓度对吸光度的影响

2.4 显色反应温度对显色反应影响

研究在98%乙醇作为反应介质、测量波长为505 nm、HCl浓度为2 mmol／L的条件下，反应温度对显色反应的影响。试验结果（图4）表明，反应温度从20℃增加到50℃，吸光度随显色反应温度的提高而增加，大于60℃之后，吸光度变化较少。确定最佳显色反应温度为50℃。

图4 显色反应温度对显色反应影响

2.5 显色反应时间对显色反应影响

研究在98%乙醇作为反应介质、测量波长为505 nm、HCl浓度为2 mmol／L、反应温度为50℃的条件下，显色反应时间对显色反应的影响。试验结果（图5）表明，反应时间从0 min增加到10 min时，吸光度随反应时间的延长而增加，大于10 min之后，吸光度变化趋于平缓。确定最佳显色反应时间为15 min。

图5 显色反应时间对显色反应影响

2.6 反应介质中Fe2＋浓度对显色反应影响

研究在98%乙醇作为反应介质、测量波长为505 nm、HCl浓度为2 mmol／L、反应温度为50℃、反应时间为15 min的条件下，Fe2＋浓度对显色反应的影响。试验结果（图6）表明，反应介质中Fe2＋质量浓度从0 mg／L增加到10 mg／L，吸光度随着 Fe2＋浓度增加而增加，当Fe2＋质量浓度大于10 mg／L时，吸光度变化不大，说明此时Fe2＋浓度对显色反应影响较小。确定反应介质中Fe2＋最佳浓度为15 mg／L。

图6 反应介质中Fe2＋浓度对显色反应影响

2.7 反应介质中KSCN浓度对显色反应影响

研究在98%乙醇作为反应介质、测量波长为505 nm、HCl浓度为2 mmol／L、反应温度为50℃、反应时间为15 min、Fe2＋质量浓度为 15 mg／L的条件下，KSCN浓度对显色反应的影响。试验结果（图7）表明，反应介质中KSCN质量浓度从0 g／L增加到1 g／L，吸光度随着KSCN浓度增加而增加，当KSCN质量浓度大于1 g／L时，吸光度变化不大，说明此时KSCN浓度对显色反应影响较小。确定反应介质中KSCN最佳质量浓度为3 g／L。

图7 反应介质中KSCN浓度对显色反应影响

2.8 共存物质干扰试验

试验结果表明，BPO含量相对误差在5%之内时，十倍的 Na＋、K＋、Sr2＋、Ag＋、Mg2＋、NH4＋、Ba2＋、Cl－、NO3－对测定结果无干扰，等量的 Mo（V），W（V）干扰测定。而小麦粉中Mo（V）、W（V）天然含量

较少，所以此方法抗干扰能力强。

2.9 标准曲线与检出限

根据上述试验结果，确定最佳的试验条件为：显色反应在乙醇介质中进行，乙醇含量为98%，测量波长为505 nm，反应温度为50℃，反应时间为15 min。反应介质中 HCl、Fe2＋和 KSCN的浓度为别为 2 mmol／L、15 mg／L和 3 g／L。标准曲线试验结果（图8）表明，标准曲线相关系数R2＝0.999 4，高于其他已发表的、利用可见分光光度计的 BPO检测方法［6－7］。经过换算，BPO表观摩尔吸光系数 ε＝2.136 5×104L·mol－1·cm－1，检出限为 0.025 mg／L。BPO浓度在0.1～15 mg／L范围内符合朗伯－比尔定律，BPO最大浓度为最小浓度的150倍，线性范围大于其他已发表的、利用可见分光光度计的BPO检测方法［6－7］。

图8 BPO标准曲线

2.10 样品分析及回收试验

最佳试验条件下，进行BPO样品分析和回收率试验，结果（表1）表明，本方法样品测定回收率在97.2%～104.4%之间。

表1 市售小麦粉样品分析结果及回收率（n＝6）

3 结论

本研究建立一种BPO检测方法，并对该方法进行试验条件研究，包括光谱吸收曲线、反应介质、酸含量、反应温度、反应时间、Fe2＋浓度、KSCN浓度、共存干扰物质等因素对检测结果的影响。确定的最佳试验条件为：显色反应在乙醇介质中进行，乙醇含量为98%，测量波长为505 nm，反应温度为50℃，反应时间为15 min。反应介质中HCl、Fe2＋和KSCN的浓度为别为2 mmol／L、15 mg／L和3 g／L。最佳试验条件下，本方法测定BPO的线性范围为0.1～15 mg／L，标准曲线为y＝0.088 2x＋0.029 9，相关系数 R2＝0.999 4，505 nm处表观摩尔吸光系数 ε＝2.136 5×104L·mol－1·cm－1，检出限0.025 mg／L。利用该方法对市售小麦粉样品进行测定，回收率在97.2%～104.4%之间。

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