红皮云杉针叶挥发油气相色谱-质谱指纹图谱及多成分定量分析

赵宏博于淼孟繁颖苏瑞宗希明方洪壮

（1佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯154007；2哈尔滨市第一医院，哈尔滨 150010）

红皮云杉针叶挥发油气相色谱-质谱指纹图谱及多成分定量分析

赵宏博1于淼1孟繁颖1苏瑞2宗希明1方洪壮1

（1佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯154007；2哈尔滨市第一医院，哈尔滨 150010）

目的：建立红皮云杉针叶挥发油气相色谱（GC）-质谱（MS）指纹图谱及多指标成分含量测定分析方法。方法：采用GC-MS技术，以HP-5MS色谱柱为分析柱，对黑龙江省的10批红皮云杉针叶挥发油分别进行指纹图谱的测定和樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯3个成分的含量测定。结果：指纹图谱中鉴定了22个共有峰，10批红皮云杉针叶挥发油的指纹图谱相似度大于0.90；红皮云杉针叶挥发油中樟脑、龙脑和乙酸龙脑酯在含量上存在一定差异。结论：系统方法学验证说明该方法可用于红皮云杉针叶的鉴别与品质评价。

红皮云杉；气相色谱-质谱；指纹图谱；多成分含量测定

红皮云杉（Picea koraiensis Nakai）为松科云杉属植物，又名虎尾松、红皮臭等，主要分布在我国小兴安岭、长白山林区一带。松叶挥发油已被证实具有镇痛、抗炎、镇咳、祛痰、抗突变、降血脂、降血压及抑菌等作用，同时也是香料、食品及化学工业上的重要原料[1-5]。相关研究发现红皮云杉与几种松科植物挥发油在化合物数量和含量上存在异同[6]。揭示红皮云杉挥发油内在的化学本质和

确定某些成分的含量，对红皮云杉挥发油的药理研究及资源利用有重要意义。在天然药物的研究中，指纹图谱结合多指标定量现已被公认为是评价与控制天然药物质量的有效技术手段[7-10]。本研究首次建立了红皮云杉针叶挥发油气相色谱（GC）指纹图谱，对共有峰进行质谱（MS）定性，同时对樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯3个高含量成分进行定量测定，数据分析结果可供红皮云杉挥发油相关研究参考。

1 仪器和试药

HP7890A-5975型 GC-MS联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；标准玻璃挥发油提取器。

樟脑（批号100903761）、龙脑（批号10147015）、乙酸龙脑酯（批号1000888484）、萘（批号BCBD 5685V），均由 SIGMA公司所提供；正己烷（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）、无水硫酸钠(上海绿源精细化工厂，色谱纯）。10批红皮云杉新鲜针叶（编号分别为A～J）于2010年8月采于小兴安岭地区，经形态和显微鉴定为松科、云杉属植物红皮云杉的针叶。

2 实验方法与结果

2.1 GC-MS指纹图谱

2.1.1 供试品溶液的制备 取阴干粉碎后的红皮云杉针叶约50 g，置1 000 mL圆底烧瓶中，加入10倍量的蒸馏水，加热回流 6 h，分取油层，加适量无水硫酸钠脱水，制取挥发油。取经由水蒸汽蒸馏法提取制得的红皮云杉针叶挥发油0.1 mL，加正己烷40 mL，摇匀。

2.1.2 GC-MS条件 色谱柱为HP-5MS（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）石英毛细管柱，进样口温度280℃，初始柱温50℃，以3℃/min升至140℃，保持10 min，以15℃/min升至215℃，以5℃/min升至260℃，保持2 min。载气为高纯氦气，分流比为40∶1，进样量1 μL。电子轰击离子源（EI）温度：230℃，接口温度 280℃，四级杆温度 150℃，扫描范围30～500 aum，溶剂延迟时间为3.75 min。

2.1.3 特征峰和参照峰的选择与确定 通过GC-MS方法得到10批红皮云杉针叶挥发油的总离子流图，选取保留时间及峰面积比较稳定的共有色谱峰共计22个（见图1）。通过NIST08质谱库对这22个色谱峰进行定性，22个色谱峰面积占总峰面积的（82.59±3.13）%。以其中峰面积较大且分离度良好的10号峰乙酸龙脑酯（21.31 min）为参照峰（S），计算各峰的相对质量。所选定的共有峰的保留时间和相对质量分数见表1。

图1 10批红皮云杉针叶挥发油的共有峰和参照峰

表1 10批红皮云杉针叶挥发油的共有峰

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度 取供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次。供试品溶液指纹图谱中各共有峰的相对保留时间的RSD为0.01%～0.07%，相对峰面积的RSD为0.50%～2.43%，测定条件下仪器精密度良好。

2.1.4.2 稳定性 取供试品溶液，按上述色谱条件下分别在0，2，4，8，12，24 h进样。供试品溶液指纹图谱中各共有峰的相对保留时间的RSD为0.03%～0.10%，相对峰面积的RSD为1.05%～4.42%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.4.3 重复性 同一批红皮云杉针叶挥发油6份，分别按2.1.1项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。供试品溶液指纹图谱中各共有峰的相对保留时间的RSD为0.01%～ 0.05%，相对峰面积的RSD为0.69%～4.56%，方法重复性良好。

2.1.4.4 共有模式及相似度 对10批红皮云杉针叶挥发油的指纹图谱分别按平均值法和中位数法建立全谱的共有模式，并计算各指纹图谱与共有模式的相似度，结果见表2。可知各挥发油与所建立的共有模式的相似度均大于0.90，所建立的共有模式具有很好的代表性。

表2 10批红皮云杉针叶挥发油的相似度

2.2 含量测定

2.2.1 内标溶液的制备 称取内标物萘50 mg，置10 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，制成5 mg/mL的溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取樟脑、龙脑和乙酸龙脑酯对照品25，25，50 mg置5 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液，保存于4℃冰箱中。临用时，精密量取适量，用正己烷稀释。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密吸取挥发油50 μL，置10 mL量瓶中，加内标溶液1 mL，加正己烷至刻度。

2.2.4 GC-MS条件 色谱柱为HP-5MS（30 m× 0.25 mm×0.25 μm)石英毛细管柱，进样口温度280℃，初始柱温50℃，以3℃/min升至125℃，后运行20 min。载气为高纯氦气，分流比为40∶1，进样量1 μL。EI温度230℃，接口温度280℃，四级杆温度150℃，扫描范围30～500 aum，溶剂延迟时间为3.75 min。此条件下，樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯及内标萘的分离度与其邻近物质的分离度均大于1.5，色谱峰的理论板数均大于10 000。供试品溶液的总离子流图见图2。

图2 红皮云杉针叶挥发油定量总离子流1：樟脑；2：龙脑；S：萘（内标）；3：乙酸龙脑酯

2.2.5 方法学考察

2.2.5.1 线性关系 精密量取混合贮备液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mL置10 mL量瓶中，分别加入1 mL内标溶液，用正己烷稀释至刻度，摇匀，得1～ 6号工作液。在上述色谱条件下，吸取1 μL注入气相色谱仪。以各成分峰面积与内标物峰面

积的比值（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制各成分的标准曲线。樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯的回归方程、相关系数和线性范围见表3。

表3 樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯的回归方程和线性回归系数

2.2.5.2 精密度 取混合对照品贮备液0.6 mL置10 mL量瓶中，加入1 mL内标溶液，用正己烷稀释至刻度，按上述色谱条件连续进样6次，计算樟脑、龙脑及乙酸龙脑酯的峰面积与内标物峰面积的比值。RSD分别为0.2%，0.3%，0.3%，精密度良好。

2.2.5.3 稳定性 取供试品溶液，按上述色谱条件下分别在0，2，4，8，12，24 h进样，计算樟脑、龙脑及乙酸龙脑酯的峰面积与内标物峰面积的比值。RSD分别为0.4%，1.9%，1.5%，供试品溶液中樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯 3个成分在24 h内均稳定性良好。

2.2.5.4 重复性 取同一批红皮云杉针叶挥发油6份，分别按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算樟脑、龙脑及乙酸龙脑酯的峰面积与内标物峰面积比值。RSD分别为0.6%，0.4%，0.2%，方法重复性良好。

2.2.5.5 加样回收率 精密量取已知樟脑、龙脑及乙酸龙脑酯含量的挥发油25 μL共6份，每份分别加入混合储备液0.3 mL，按2.2.3项下制备方法制得溶液，在设定的色谱条件下进行测定。计算得，樟脑、龙脑及乙酸龙脑酯的平均回收率（n=6）分别为99.6%（RSD=1.9%），97.1%（RSD= 1.8%），100.7%（RSD=1.7%）。

2.2.6 供试品含量测定 取不同产地的红皮云杉针叶挥发油，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，在2.2.4色谱条件下测定，并由标准工作曲线计算10批红皮云杉针叶挥发油3种成分的含量，见表4。从中可知，不同产地样品中樟脑、龙脑及乙酸龙脑酯的含量均差异较大，最高达2～3倍以上。

表4 10批红皮云杉针叶挥发油3种成分含量（mg/mL）

3 讨论

3.1 目前色谱指纹图谱的共有模式有两种，即峰方式及全谱方式。鉴于红皮云杉针叶挥发油在GC-MS测定下，所呈现的化学成分种类数目众多，为了兼顾指纹图谱的整体性和模糊性，采用了全谱方式来建立其共有模式并进行指纹图谱相似度的考察。

3.2 红皮云杉针叶挥发油中樟脑、龙脑及乙酸龙脑酯定量时，根据分析目的的不同，采用了与指纹图谱测定不同的升温程序。该条件下不仅目标物的色谱行为满足定量要求，并且分析时间相对较短。

3.3 红皮云杉针叶挥发油的 GC-MS数据经解析得知，该挥发油中不含有化合物萘，又基于萘的色谱保留时间和分子特性上满足于作为内标物质的要求，故在樟脑、龙脑及乙酸龙脑酯定量时，采用萘作为内标物。

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Gas Chromatography-Mass Spectrometry Fingerprint of Volatile Oil in Picea koraiensis Nakai Leaves and Quantitative Analysis of Multiple Components

Zhao Hongbo1，Yu Miao1，Meng Fanying1，Su Rui2，Zong Ximing1，Fang Hongzhuang1（1 College of Pharmacy of Jiamusi University，Heilongjiang Jiamusi 154007，China；2 The First Hospital of Harbin City，Harbin 150010）

Objective:To establish an analysis method for the gas chromatograph-mass spectrometry（GC-MS）fingerprint and the content determination of multiple components of volatile oil in Picea koraiensis Nakai leaves.Methods:Fingerprint determinations of 10 lots of volatile oil of Picea koraiensis Nakai leaves from Heilongjiang Province were conducted and the contents of borneol，bornyl acetate and camphor were determined by using GC-MS technology with HP-5MS chromatographic column.Results:About 22 common peaks were confirmed in the fingerprints and the similarities of 10 lots of volatile oil of Picea koraiensis Nakai were higher than 0.90.The results of content determination demonstrated that some differences existed among camphor，borneol and bornyl acetate.Conclusion:The validation of systematic methodology showed that the method can be used for the identification of volatile oil of Picea koraiensis Nakai leaves and the evaluation of the quality of volatile oil.

Picea koraiensis Nakai；Gas Chromatography-Mass Spectrometry；Fingerprint；Content Determination of Multiple Components

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.11.006

2012-06-21）

赵宏博，男，硕士。研究方向：中药的活性成分和质量控制。

方洪壮，男，教授。研究方向：计算药物分析、中药分析。通讯作者E-mail：fhz-chjms@sohu.com