不同年龄段人血清中酸性肽的HPLC分析

谢江涛，安玉会，王洁琼，贺司宇，毛红利，施佳辰，徐 霞

(郑州大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室 河南郑州 450001)

在早老性痴呆病(Alzheimer’s disease，AD)第一个临床症状出现之前的20～30 a中，神经退行性改变就已开始。因此，寻找和发现用作早期预警的生物标志物，预先发现神经退行性改变对于老年痴呆病的预防和治疗以及预后都有重要的临床意义［1］。当前，老年痴呆病的生物标志物研究主要聚焦于血液和脑脊液这两种体液中的肽和蛋白质上［2］。尤其是血液样品，容易获得，对人体伤害小，比脑脊液具有更大的临床应用价值［3］。β-淀粉样肽(β-amyloid peptide，A)和tau蛋白是两种公认的引起神经退行性改变的病因学分子。在AD病人脑脊液中β-淀粉样肽的水平降低，而tau蛋白水平增加［4］。尽管测定人血液中tau蛋白水平意义巨大，但tau蛋白释放到血中的量比急性中风病人要低很多［3］。因此，tau蛋白在血中的水平作为老年痴呆病的生物标志物尚不够理想。血中β-淀粉样肽的水平测定显示，AD病人组和正常对照组人群血中Aβ40和Aβ42的水平不存在有意义的差异［5］。为了从血液中寻找神经退行性改变的早期预警性生物标志物，对不同年龄人群血清中酸性肽的含量进行了HPLC分析。

1 材料与方法

1.1 血清样品的收集和分组处理 收集2010年10月至2011年10月来郑州大学第一附属医院抽血化验的不同年龄人群的血清样品，排除有脑疾病，血液疾病和传染病的血清样品并冻存于－80℃冰箱。按年龄大小将血样分为1～10岁组(A组)，20～30岁组(B组)，40～59岁组(C组)和60～80岁组(D组)4组。每个血清样品分别抽取1 ml放入干锅瓶中，60℃烘箱过夜烘干。加入含有酸性肽内标的生理盐水1 ml彻底溶解后转移至离心管中，10 000 r/min离心5 min。收集上清液备用。

1.2 血清样品的HPLC分析 按照Chakraborty AB等人［6］介绍的方法进行分析。HPLC仪为:Agilent 1 200/ 1 100LC(美国安捷伦公司制造)。HPLC柱为:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)。洗脱液甲醇。流速0.5 ml/min。测定波长225 nm。进样量10 μl。

1.3 统计学分析 HPLC分析所获得的样品和内标的积分面积用以下公式计算出酸性肽的含量。

酸性肽的含量(mg/ml)=(样品的积分面积-内标的积分面积)/内标的积分面积×内标的含量(mg/ml)

数据用SPSS12.0进行统计学分析，各组数据分别与1～10岁组比较，进行t检验分析。不同年龄组的组内进行F检验分析，数据用±s表示。组间数据比较用t检验。检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 单独内标(酸性肽纯品)的HPLC图 见图1。

图1 内标(酸性肽纯品)的HPLC图

2.2 血清样品(含有内标)的HPLC图 见图2。

2.3 血清样品的HPLC分析结果 血清样品经HPLC分析，其酸性肽的含量列于表1中。

图2 血清样品(含有内标)的HPLC图

表1 血清样品经HPLC分析后酸性肽的含量(±s)

表1 血清样品经HPLC分析后酸性肽的含量(±s)

总F=2.898，P﹤0.05。

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3 讨论

酸性肽是本实验室分离纯化获得的一个新的小分子神经肽［7］。HPLC分析的结果显示，20～30岁组和40～59岁组人群血清中酸性肽的含量比1～10岁组人群血清中酸性肽的含量明显降低。统计学分析表明，20～30岁组和40～59岁组人群血清中酸性肽的含量与1～10岁组分别比较，差异均有显著性。这说明随着人体的成熟，成年人血清中酸性肽的含量比少儿时人血清中酸性肽的含量是减少的。而当超过60岁以后，人血清中酸性肽的含量明显升高，与1～10岁组人群血清中酸性肽的含量基本相似。因此，60～80岁组人群血清中酸性肽的含量与1～10岁组比较，差异无显著性。这说明少儿人群和老龄人群血清中酸性肽的含量相似。少儿人群和60岁以上的老龄人群是神经功能较为低下的两个年龄段。尤其是老龄人群，随着机体的衰老，其脑内酸性肽释放到血液中的速度可能增加。因而脑内酸性肽的含量就可能降低，从而导致脑内酸性肽抑制APP，BACE(B-site APP cleaving enzyme)和tau蛋白产生的能力降低［8］，也由此降低了酸性肽抑制神经元凋亡的能力［9］，最终也就导致了脑的退行性事件的发生。

APP(amyloid precursor protein)是存在于神经细胞膜上的β-淀粉样前体蛋白。APP经β分泌酶(即BACE)和γ分泌酶水解形成β-淀粉样肽［10］。β-淀粉样肽主要沉积于神经细胞外，损伤并导致神经元的凋亡和丢失［11］。另外，由于β-淀粉样肽的瀑布效应，就会启动tau蛋白的过度磷酸化，在神经细胞内形成神经缠丝，这就会进一步加速神经元的凋亡和神经退行性的发生和发展［12］。

HPLC分析已经广泛应用于小分子化合物和各种肽类化合物的分析纯化［13，14］，并在蛋白质组学研究中应用［15］。本研究采用内标法和高效液相色谱分析法测定了人血清中酸性肽的含量，获得了良好的结果。但老年痴呆病人及其家族聚集人群血中酸性肽的含量需要进一步分析研究。

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