替加氟栓质量标准提高研究＊

(重庆市食品药品检验所，重庆 401121)

替加氟为抗肿瘤药物，作用机理、疗效及抗瘤谱与氟尿嘧啶相似，与氟尿嘧啶相比作用持久、吸收良好、毒性较低。替加氟栓临床上主要用于结肠癌、直肠癌等疾病[1]，国外除日本药局方第十六改正收载了替加氟原料的质量标准外，其他各国药典均未收载。经试验研究发现，替加氟栓现行质量标准中鉴别和含量测定的专属性不强，不能有效区分替加氟及其主要杂质氟尿嘧啶，且无有关物质检查项。在标准提高工作中，笔者着重对上述存在的问题进行了考察，拟订了高效液相色谱(HPLC)法鉴别和含量测定法，并增加了有关物质检查法。现报道如下。

1 仪器与试药

替加氟对照品(批号为100468－200401，中国药品生物制品检定所);甲醇、乙腈(色谱纯)，试验用水(超纯水);替加氟栓(国内市售品，成都第一制药有限公司，威海华新药业集团有限公司，规格为每枚 0.5 g，批号为 101001，100701)。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

2.2 高效液相色谱鉴别

在含量测定项下记录的色谱图(图1)中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。两批供试品溶液主峰的保留时间均与对照品溶液主峰的保留时间一致。

图1 高效液相色谱图

2.3 有关物质检查

2.3.1 拟订方法

精密称取本品适量，加流动相定量稀释成每1 mL中约含0.2 mg的溶液作为供试品溶液;精密量取适量，用流动相定量稀释成每1 mL中含2 μg的溶液，作为对照溶液;另取氟尿嘧啶对照品，精密称定，加流动相溶解并定量稀释成每1 mL中约含1 μg的溶液，作为对照品溶液。照高效液相色谱法[2]测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇－乙腈－水(10∶5∶85)为流动相，检测波长为271 nm，理论板数按替加氟峰计算不低于1 500，替加氟峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%;再精密量取供试品溶液、对照溶液与对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中，如出现与对照品溶液色谱图中氟尿嘧啶保留时间一致的峰，按外标法以峰面积计算，其含量不得大于标示量的0.5%，其他各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的 0.5 倍(0.5%)。

2.3.2 检测波长选择

在该色谱条件下，替加氟与氟尿嘧啶在271 nm波长处均有吸收，故选择271 nm作为检测波长。

2.3.3 专属性试验

酸破坏:取批号为101001的样品约72 mg，置100 mL容量瓶中，加1 mol/L盐酸溶液5 mL，置80℃水浴中加热10 min，冷却，加1 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

碱破坏:取批号为101001的样品约72 mg，置100 mL容量瓶中，加1 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，置80℃水浴中加热10 min，冷却，加1 mol/L盐酸溶液5 mL，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

氧化破坏:取批号为101001的样品约72 mg，置100 mL容量瓶中，加30%过氧化氢溶液，置80℃水浴中加热10 min，冷却，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

高温破坏:取批号为101001的样品约72 mg，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，置80℃水浴中放置半小时，冷却，作为供试品溶液。

1若宝宝烫伤较严重，除去衣服时，已有明显的红色渗水的创面（表皮已烫掉）就不要再用水冲洗，以免感染；也不要把冰块直接放在伤口上降温，以免皮肤组织冻伤。应用庆大霉素加生理盐水擦拭患处，用纱布严密包裹后，立即送医院进行治疗。

光破坏:取批号为101001的样品约72mg，置100mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，置日光下放置72h，作为供试品溶液。

取上述破坏后的供试品溶液，照拟订的色谱条件进样分析，记录色谱图(见图2)。可见，样品经破坏后产生的降解产物均能与替加氟和氟尿嘧啶峰有效分离，用二极管阵列检测器在200～400 nm波长范围内扫描，替加氟和氟尿嘧啶的纯度均符合要求，说明拟订的色谱条件可用于测定替加氟片的有关物质。

图2 破坏试验高效液相色谱图

2.3.4 方法学考察

线性关系考察:取替加氟对照品适量，用流动相溶解并稀释制成系列质量浓度的对照溶液，进样20 μL测定。回归方程为A=50.062 C+9.217 8，r=1.000(n=5)。结果表明替加氟质量浓度在 5.92 ～47.36 μg/mL 范围内线性关系良好。

系统耐用性试验:分别用菲罗门、安捷伦公司等不同品牌的色谱柱及Agilent 1100型、Waters 2695型不同型号的色谱仪，按拟订的条件试验。检验结果基本一致，说明方法的耐用性较好。

加样回收试验:精密称取氟尿嘧啶对照品0.01149g，置100mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，精密量取20 mL，加流动相稀释至100 mL，摇匀，即得加样对照品贮备液。精密称取同一批样品(成都第一制药有限公司)20 mg，置100 mL容量瓶中，共9份，分别精密加入加样对照品贮备液4，5，6 mL(各3份)，加甲流动相稀释至刻度，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按拟订的色谱条件测定，计算回收率。结果见表1。

表1 氟尿嘧啶加样回收试验结果(n=9)

2.3.5 样品检测结果

样品有关物质测定结果见表2。可见，两批样品中氟尿嘧啶杂质含量小于标示量的0.5%，其他杂质峰面积总和低于规定的限度。因此，将替加氟栓的有关物质限度规定为氟尿嘧啶杂质含量不得过0.5%，总杂质不得过0.5%。

表2 样品有关物质及含量测定结果

2.4 含量测定

2.4.1 拟订方法

含量测定:照高效液相色谱法(附录V D)测定[2]。

色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇－乙腈－水(10∶5∶85)为流动相，检测波长为271 nm。理论板数按替加氟计算不低于1 500，替加氟峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。

测定法:取本品10粒，精密称定适量(约相当于替加氟50 mg)，置50 mL量瓶中，加流动相适量，温热，振摇使替加氟溶解，冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液适量，用流动相定量稀释成每1 mL中约含20 μg的供试品溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图;另取替加氟对照品，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL约含20 μg的对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

2.4.2 方法学考察

重复性试验:取批号为101001的样品，精密量取6份，照拟订的方法测定。结果替加氟含量分别为标示量的 95.7%，94.2% ，94.3% ，95.8% ，95.6% ，95.6% ，平均 95.2% ，RSD=0.78%(n=6)，表明方法重现性好。

精密度试验:取同一对照品溶液，连续进样6针。结果替加氟峰面积分别为 1 216，1 214，1 214，1 225，1 210，RSD=0.46%(n=6)，表明仪器精密度良好。

定量限及检测限确定:精密称取替加氟对照品0.010 93 g，置50 mL容量瓶中，加流动相溶解后，并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀;精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀;精密量取1 μL 进样。结果检测限为 0.001 μg/mL，定量限为 0.004 μg/mL。

线性关系考察:同有关物质检查项。

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别于配制后 0，1，2，4，6，8 h时依法进样。结果替加氟峰面积分别为1 216，1 207，1 201，1 198，1 199，1 188，RSD=0.78%(n=6)，表明供试品溶液在 8 h内基本稳定。

加样回收试验:精密称取替加氟对照品0.195 0 g，置100 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得加样对照品贮备液。精密称取样品10 mg，置50 mL容量瓶中(共9份)，分别精密加入加样对照品贮备液4，5，6 mL(各3份)，加流动相稀释至刻度，摇匀，再精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密称取替加氟对照品0.011 84 g，置50 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加上述溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。精密量取上述供试品溶液、对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。结果见表3。

2.4.3 样品含量测定

按拟订的含量测定方法测定样品含量，并与现行质量标准中紫外分光光度(UV)法测定结果进行比较。结果见表2。根据样品实际测定结果，含量限度仍定为“本品含替加氟(C8H9FN2O3)应为标示量的 90.0% ～110.0%”。

表3 替加氟含量测定加样回收试验结果(n=9)

3 讨论

替加氟栓现行质量标准中无有关物质检查项，鉴别和含量测定均采用UV法。由于替加氟与其主要杂质氟脲嘧啶紫外光谱相似，UV法不能有效控制产品质量，而采用高效液相色谱法能有效分离并测定氟脲嘧啶和其他有关物质。

现行质量标准用UV法测定替加氟含量时，栓剂基质和氟尿嘧啶会对测定结果有影响。HPLC法能将替加氟与基质、杂质峰有效分离，测定结果更准确、可靠。

[1]WS－10001－(HD－0162)－2002，国家药品标准·化学药品地方标准上升国家标准(第二册)[S].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录ⅤD.