硬化性牙本质粘结界面形态观察和粘结强度的研究

朱丹丹，李秋红

(1.四平卫生学校 口腔教研室，吉林 四平136000;2.大连医科大学 附属第一医院 口腔科，辽宁 大连116011)

牙体粘结在现代口腔粘结学领域中，尤其是牙体美学修复方面占有非常重要的地位，例如牙体贴面、全冠粘结、纤维桩应用等都涉及到牙体粘结。牙体粘结包括牙釉质粘结和牙本质粘结。关于正常牙本质粘结的实验研究多有报道，但实际临床遇到的牙本质粘结很多是针对硬化性牙本质的。所以，本实验拟选用临床常用的且具有代表性的全酸蚀粘结系统，将复合树脂粘结于不同性质的牙本质表面，采用TEM 观察粘结界面的微观形态，并利用微拉伸测试方法对其粘结强度进行测试，希望为临床研究提供帮助和依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验用离体牙:选择2010年上半年在大连医科大学附属第一医院口腔颌面外科17 例患者因牙周病而拔除的磨牙20 颗，牙合面具有典型硬化性牙本质，视觉分级三级以上(根据North Carolina dentine sclerotic scale［1］)为实验组。另选择8 例患者因正畸减数而拔除的前磨牙20 颗，根尖孔已形成为对照组。

使用超声洁治器去除所有新鲜样本牙的菌斑和牙石，离体牙在1%氯胺溶液中4 ℃存放，拔除后1个月内使用。

1.1.2 实验材料和设备:全酸蚀处理系统:35%磷酸(3M ESPE，美国)、Single Bond 粘结剂(3M 公司，美国)、复合树脂Z350 (3M USA)、光固化机(Dentsply，Germany)、透射电镜(TEM 2000EX Jap)、微拉伸测力仪(Bisco，USA)、电子游标卡尺(上海台海工量具有限公司)、低速切割锯(北京中兴百瑞技术有限公司)、超声波洁牙机 (EMS France)。

1.2 实验方法

1.2.1 全酸蚀粘结处理:将具有正常牙本质的20颗前磨牙颌面牙釉质在流水下用金刚砂车针磨除，暴露其平整的表层牙本质后用全酸蚀处理，即对照组;20 颗磨牙颌面均为硬化性牙本质，稍稍打磨平整后直接用全酸蚀处理，即实验组。处理方法为:经35%磷酸酸蚀粘结面20 s，蒸馏水加压冲洗20 s，然后用无油气枪轻轻吹走牙本质表面多余水分，但保持表面湿润。Single Bond 粘结剂均匀涂布在粘结面上，停留10 s 后，用气枪轻轻将粘结剂均匀吹平展开，然后再涂一层粘结剂，将过多粘结剂用小毛刷吸出，光固化灯照射20 s。再用可见光固化复合树脂Z350 修复牙冠至4 ～5 mm 高。修复过程中应用分层固化技术:第一层厚约1.5 mm，后两层每层厚约1.25 mm，每层均光照60 s。

将粘结后每一个牙体沿与牙长轴平行的方向分成两部分，一半用于TEM 观察实验试件制备，另一半用于微拉伸粘结强度测试试件制备。

1.2.2 TEM 观察实验试件制备:将样本用金刚砂车针磨小，牙本质部分有粘结面、有牙本质暴露面。将样本置于含有41.3 g/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)和4.4 g/L NaOH 的水溶液中脱矿24 h［2］。用含有2. 5 %戊二醛的0. 1 mmol/L 二甲基砷酸钠缓冲液(pH 7.4)在4 ℃时固定12 h;0.1 mmol/ L 二甲基砷酸钠缓冲液冲洗1 min;7% 锇酸后固定;50 %、75 %、95 %、100 %酒精各10 min 梯度脱水;1∶1 无水酒精和环氧树脂中浸透1 h 后用100 %环氧树脂再浸透3 h，环氧树脂包埋，真空状态下去除气泡15 min;60 ℃恒温箱聚合48 h。半薄切片厚度约为1 μm，甲苯胺蓝染色后光镜下定位;超薄切片厚度为90 nm;醋酸铀染色8 min，柠檬酸铅染色3 min。用TEM 对试件进行微观结构的观察。

1.2.3 微拉伸粘结强度测试试件制备:粘结完成后的牙齿置于37℃蒸馏水中储存24 h 后，包埋于自凝树脂中，沿与牙长轴平行的方向，用慢速锯垂直于粘结界面切开，切成粘结面积为1.2 mm ×1.2 mm，高为8 mm 的数个长方体微拉伸试件。

1.2.4 微拉伸粘结强度测试:对实验组和对照组各随机选取20 例试件进行微拉伸强度测试。用氰基丙烯酸粘合剂固定于微拉伸测试仪上，加载速度选择为1 mm/min，直至试件断裂后记录载荷峰值(N)，准确测量每个试件粘结面的实际面积(mm2)。根据微拉伸粘结强度(MPa)计算公式MPa = N/mm2，得出结果。

1.3 统计学方法

实验数据用SPSS 11.5 软件做两个独立样本t检验进行分析，检验水准为:双侧α=0.05。

2 结 果

2.1 TEM 对粘结界面形态的观察结果

全酸蚀处理后，实验组可见大部分区域牙本质与粘结剂粘结紧密无缝隙，牙本质小管内可见钙化盐充盈物，见图1;部分区域可见粘结剂成层排列，且出现分离现象，见图2。对照组部分区域可见牙本质小管内有充盈物，见图3。部分区域还可见牙本质与粘结剂之间有碎裂，结合不紧密，见图4。对照组与实验组大部分区域牙本质小管内相对干净，全景未见明显渗入牙本质内的树枝状突起。

2.2 微拉伸实验粘结强度

硬化性牙本质组微拉伸实验粘结强度(38.43 ±2.28)，与正常牙本质组(40.55 ±4.34)比较较低，差异有显著性意义(P ＜0.05)。

图4 正常牙本质组TEM 图像(×5 000)Fig 4 TEM of sound dentine group (×5 000)

3 讨 论

3.1 硬化性牙本质本身的结构特点

硬化性牙本质是结构和组成随着增龄、龋病、磨耗等因素发生了生理及病理改变的牙本质，主要指牙本质小管中沉积了钙化盐结晶体，堵塞了牙本质小管，这可导致其内在水的含量减少。由于牙本质粘结表面经酸蚀脱矿后，胶原纤维网暴露，正常情况下混杂在牙本质无机质中并交叉呈网状的胶原纤维，此时基本上由牙本质表面的水分来支持其蓬松的结构。胶原纤维网中的空隙成为亲水性粘结单体向下方牙本质渗透的必需通道。如果这一通道畅通，粘结剂充分向牙本质表面和牙本质小管中渗透，并进入到脱矿后的牙本质侧枝小管中，即可形成较厚的混合层和完整的树脂突起［3］。而现在硬化性牙本质内含水量减少，那么这一通道就不通畅，即牙本质通透性大大下降，阻止粘结剂的渗透，导致树脂突形成也减少，这些是使其粘结强度下降的最主要原因［4］。本实验显示硬化性牙本质经全酸蚀粘结处理后与正常牙本质比较，混合层厚度有差异，树脂突差异不明显。可能是因为硬化性牙本质通透性大大下降，内在水的含量也减少，阻止了粘结剂和树脂渗透。而表面塌陷的胶原纤维网也不利于有机溶剂的挥发，从而使有机溶剂中的水分去除不充分，使得粘结界面中粘结性单体的密度降低，所以没有形成明显的树脂突;且牙本质小管中又沉积了钙化盐充盈物，增加了对酸的抵抗性，树脂突形成就更少了。

3.2 对牙本质的处理方法不同的影响

临床常用于牙本质粘结的处理方法很多，而本实验中采用的是步骤多的传统的三步法全酸蚀粘结剂。经全酸蚀粘结系统处理的牙本质，管间牙本质脱矿，胶原纤维微孔支架暴露，同时牙本质小管开放，底胶润湿并渗入胶原纤维间的微孔及牙本质小管，这有利于粘结剂的随后渗入，且底胶和粘结剂在原位固化后，即与牙本质胶原纤维形成相互扣锁的混合层，内含有许多树脂突［5］，这成为产生牙本质粘结力的主要来源［6］。

本实验中所用到的离体牙均4℃下储存于1%氯胺溶液中1 个月内，这种储存方法能够有效地杀灭微生物，还不影响牙本质的渗透性［7］。

3.3 透射电镜(TEM)对牙本质形态的观察

在这种电子显微镜中，图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的散射形成的，由于电子需要穿过样本，因此要求样本必须非常薄，通常切片的厚度是40 ～50 nm，因为太厚电子束不能穿透，而难以在电镜下获得清晰的图像。制片过程中是需要脱矿的，如果在不脱矿的情况下，同时又要求样本切片很薄，这点往往很难实现，导致制片困难加大，成本过高。而且在制备样品过程中要求样本充分脱水干燥和包埋，使混合层底部收缩，树脂突受到损害，从而影响观察结果的真实性;也可能是TEM 本身观察范围小，制片小，因为固定液渗透速率缓慢，样品体积一般在1 mm3左右，以防样品过大而其中心部位得不到良好的固定所以制片要小。而实际上需要大面积观察才能找到更多树脂突;而且实验中试件的数量足够多才能增加结果的可信度。本实验也证实了这几点。

鉴于样品制备难度及成本等因素，一般多用SEM 观察粘结界面，且关于SEM 的报道也很多，而本实验却选用了较少使用的TEM 来观察，目的是利用TEM 分辨率比SEM 高，可以针对同一微区位置进行形貌、晶体结构、成分(价态)做全面分析，希望为临床操作提供科学依据。

3.4 微拉伸粘结强度测试

微拉伸实验检测拉伸强度的测试方法自创建以来被广泛应用于牙本质粘结实验。它要求粘结面积＜2 mm2，所以它的破坏方式中没有内聚力的破坏，全是界面破坏，应力分布均匀，多数学者采用其评估牙本质粘结剂的真实粘结强度［8］。Hass V 将一步法自酸蚀粘结系统作用于牙本质表面，其强度与粘结系统相关［9］。同时也要注意标本易折断和脱水干燥，会影响最终结果。本实验中得出的结果均在30MPa 以上，说明此种方法能够很好地检测牙本质粘结强度，优点显著，可作为常用方法之一在检测中应用。

牙本质粘结修复后的临床保持率的高低仍需要大量的临床调查来随访跟踪，仍需要实验证实和进一步地探讨。

4 结 论

3M Single Bond 全酸蚀系统处理正常牙本质与硬化性牙本质后与复合树脂粘结均可形成清晰混合层，硬化性牙本质的混合层较薄;在本实验条件下，与正常牙本质相比，硬化性牙本质与复合树脂的微拉伸粘结强度较低。

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