Pim-1蛋白激酶在肺癌组织中的表达及其临床意义

丁昭珩 赵其德 梁洪享 倪裕丰 刘合代 张 明 杨 英 丁 罡

Pim激酶家族是一组钙/钙调蛋白调节激酶(CAMP)，包括 3 个成员(Pim-1、Pim-2、Pim-3)，其中Pim-1可以参与调控细胞的增殖、分化和凋亡。目前已证实，一些实体肿瘤如前列腺肿瘤等中Pim-1存在高表达［1］，国外的最新研究提示Pim-1激酶在肺癌内也有表达。我们通过免疫组化的方法分析了70例肺癌组织中的Pim-1激酶的表达，探讨Pim-1在肺癌的病程发展中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2008年1月～2011年12月我院胸外科手术切除的确诊肺癌石蜡标本共70例，其中男性54例，女性16例，年龄43～76岁。所有病例均经组织病理学证实并有完整的临床资料，术前均未接受过任何化疗和放疗。肿瘤直径≤3 cm 33例，肿瘤直径＞3 cm 37例;有淋巴结转移36例，无淋巴结转移34例。腺癌23例，鳞癌38例，小细胞肺癌5例，腺鳞癌3例，梭形细胞癌1例。根据UICC2009版的肺癌TNM分期进行病例分期，Ⅰ期27例，Ⅱ期17例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例。随机选取癌旁3 cm以外相对正常的肺组织20例作为对照组标本。所有标本均用10%福尔马林液固定，并常规石蜡包埋，切片厚4 μm。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 兔抗Pim-1单克隆抗体购于Abcam公司;三步法组化试剂盒、山羊抗兔IgG，二氨基联苯胺(DAB)试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组织化学染色 将石蜡切片常规脱蜡，阶梯乙醇脱水，3%过氧化氢孵育5～10 min，冲洗，PBS进行热修复，0.1MPBS按1∶10稀释的羊血清封闭，37℃，20 min。磕掉羊血清，加入1∶100稀释的一抗，37℃，1 h，4℃过夜。各步以PBS代替一抗作为阴性对照。组化用0.01MPBS冲洗3次，每次3 min。加入二抗，37℃，30 min。用0.01MPBS 冲洗3 次，每次2 min。DAB显色10 min，蒸馏水终止并充分冲洗。苏木精复染，中性树脂封固。

1.2.3 染色结果判断 阴性表示无阳性细胞。弱阳性为阳性细胞质染成均匀的淡黄色或胞质呈棕色的细胞数≤50%。强阳性表示胞质染成深棕色的细胞数＞51%。

1.3 统计学分析

采用SPSS14.0 for Windows统计学处理软件进行数据分析。阳性率比较采用卡方检验，组间Pim-1的表达强度的比较采用秩和检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Pim-1表达的形态学特点

光镜下，Pim-1阳性染色为淡黄色、棕黄色、棕褐色，程度不等，广泛表达于肿瘤细胞的细胞质，部分表达于核膜，呈弥漫分布。

2.2 Pim-1在肺癌组织及正常对照组中的表达情况

正常肺组织中Pim-1的阳性率是30.00%，肺癌组织中Pim-1的阳性率是61.43%，差异具有统计学意义(χ2=6.5168，P=0.0388，＜0.05)。见表1。

表1 Pim-1在肺组织中的表达情况(例)

2.3 肺癌临床病理指标与Pim-1的表达

在肺癌患者中，Pim-1的表达与肿瘤直径TNM分期、淋巴结转移具有相关性，与患者的性别、有无吸烟史、病理分型无明显相关性。见表2。

表2 Pim-1的表达与各项临床病理指标的关系

3 讨论

近年的流行病学调查数据显示，肺癌为我国癌症发病率和死亡率上升最快的肿瘤［2］，发病率及死亡率均居肿瘤之首［3］。据统计，全球每年大约有130万人死于肺癌［4］。目前肺癌总的5年生存率只有13% ～15%。

Pim激酶家族是一组钙/钙调蛋白调节激酶(CAMP) ，该家族各成员(Pim-1、Pim-2、Pim-3)在激酶结构域高度同源，其生物学功能也存在显著的重叠。Pim-1基因编码1种丝/苏氨酸激酶，最早是作为莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入点而被发现的。Pim-1的表达非常广泛，从血生成细胞系和淋巴细胞系到口腔上皮系。研究表明，Pim-1是多种关键生长因子信号传导通路的重要组成部分，而这些信号通路在细胞的增殖、分化、凋亡等过程中发挥着重要作用。Pim-1的过度表达可以促进细胞的增殖分化，阻断多种凋亡诱导通路，干扰细胞周期的正常调控，最终导致各种恶性肿瘤的形成。Bachmann等研究发现原癌基因Pim-1是细胞因子信号传导的下游效应因子，能够通过改变几种细胞周期调节因子的活性而加快细胞周期的进程。Pim-1能够直接磷酸化Cdc25C，推进细胞周期G2/M的进程，促进细胞的增殖分化［5］。凋亡蛋白Bad的第112个丝氨酸是1个活性管家基因。Aho等［6］研究发现Pim-1激酶可使这个位点磷酸化从而使其活性丧失，保护细胞幸免于凋亡蛋白Bad的凋亡效应。Kim等［7］曾用基因型和单倍体分析对Pim-1基因多态性及肺癌发生风险间的相关性进行研究，发现Pim-1基因的T-C-T-C单倍体(1196 T＞C，IVS4+55 T＞C，IVS4+1416 T＞A和+3684 C＞A)可能影响韩国人口中发生吸烟相关性肺癌的风险。在前列腺癌方面，He等［1］研究指出前列腺癌，前列腺增生组织和正常前列腺组织中的Pim-1 mRNA含量之间比较存在统计学差异。QRT-PCR检测Pim-1 mRNA的表达量为前列腺癌的诊断提供了1个可靠的标准。田荣华等［8］采用免疫组化方法评估了53例初治原发性弥漫大B细胞淋巴瘤患者的Pim-1表达，结果显示，Pim-1蛋白高表达与弥漫大B细胞淋巴瘤的负性预后相关。Pim-1蛋白高表达患者的3年总生存率和化疗完全缓解率均较低表达者低，差异有统计学意义。表明在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中Pim-1的高表达可以作为临床预后的不良标志。

该实验结果表明，Pim-1蛋白在肺癌中表达高于正常肺组织，与文献报道相符［9，10］。肺癌组织 Pim-1的染色强度与肿瘤的TNM分期具有相关性，肿瘤分期越晚，Pim-1表达水平越高;瘤体较大的病例(＞3cm)比瘤体小者(直径≤3 cm)Pim-1表达明显增加，两者具有明显正相关性。淋巴结转移阳性的病例也较阴性者Pim-1表达增加。结果提示Pim-1与肿瘤的疾病发展程度有关。

肺癌的发生是1个多阶段、多基因、多因素参与的复杂过程，其确切的发病机制尚不明确。Pim-1在肺癌中的潜在机制以及与肺癌进展之间的关系尚需进一步研究。

［1］He HC，Bi XC，Dai QS，et al.Detection of Pim-1 mRNA in prostate Cancer diagnosis〔J〕.Chin Med J(Engl)，2007，120(17):1491.

［2］全国肿瘤防治研究办公室.中国恶性肿瘤死亡调查研究(1990-1992)〔M〕.北京:人民卫生出版社，2008:82.

［3］郭晓静，王玉明，段 勇.肺癌的表观遗传学研究进展〔J〕.实用癌症杂志，2011，26(5):528.

［4］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009〔J〕.CA Cancer J Clin，2009，59(4):225.

［5］Bachmann M，Kosan C，Xing PX，et al.The oncogenic serine/threonine Pim-1 directly phosphorylates and activates the G2/M specific phosphatase Cdc25C〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2006，38(3):430.

［6］Aho TL，Sandholm J，Peltola K J，et al.Pim-1 kinase promotes inactivation of the pro-apoptotic bad protein by phosphorylating it on the Ser112 gatekeeper site〔J〕.FEBS Lett，2004，571(1-3):43.

［7］Kim DS，Sung JS，Shin ES，et al.Association of single nucleotide polymorphisms in Pim-1 gene with the risk of Korean lung cancer〔J〕.Cancer Res Treat，2008，40(4):190.

［8］田荣华，应韶旭，李 晓，等.Pim-1表达与弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后的关系〔J〕.中国癌症杂志，2010，20(12):921.

［9］ZHANG Y，WANG Z，MAGNUSON NS.Pim-1 kinase-dependent phosphorylation of p21Cip1/WAF1 regulates its stability and cellular localization in H1299 cells〔J〕.Mol Cancer Res，2007，5(9):909.

［10］HE HC，BI XC，ZHENG ZW，et al.Real-time quantitative RT-PCR assessment of Pim-1 and hk2 mRNA expression in bengin prostate hyperplasia and prostate cancer〔J〕.Med Oncol，2009，26(3):303.