VM和MMP-2在前列腺癌组织中的表达及其临床意义

金 松 安蜀昆 汪建平 李 松

前列腺癌是老年男性泌尿生殖系统中最为常见的恶性肿瘤，其中95%以上的前列腺癌是因为前列腺腺泡细胞异常无序增生生长而发生的前列腺癌［1］。前列腺癌的发病率具有明显地理上和种族上的差异，最近几年我国前列腺癌发病率呈逐年上升趋势。目前大部分前列腺癌患者死因仍然是肿瘤的浸润和转移，近年来不少实验研究已经表明，基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)能够通过降解基膜和细胞外基质，从而促进肿瘤细胞的浸润和转移，影响肿瘤患者的生存预后［2］。无论是原发肿瘤还是转移性肿瘤的增生生长和浸润转移等一系列的过程都需要新生血管的形成以提供充足的营养供应，而在1999年有关血管生成拟态(vasvulogenic mimicry，VM)概念的提出及对其分子生物学调控机制的研究探讨为抗肿瘤微循环的治疗提供了新思路和新靶点。本实验应用血小板-内皮细胞黏附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)免疫组织化学和过碘酸雪夫氏(periodic acid-sciff，PAS)组织化学双重染色法，检测在前列腺癌组织中VM的形成，应用免疫组织化学SP法检测在前列腺癌组织中MMP-2蛋白表达［3］，探讨VM和MMP-2表达的临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取本院2009年12月～2012年12的手术切除的98例前列腺癌组织标本，并经两名有经验的病理科医师证实均为前列腺腺癌。年龄56～79岁，平均(63±7)岁。Gleason评分是反映前列腺病理学特征与其生物学行为相关性最好的分级指标，Gleason评分＞7为低分化前列腺癌组织即高危组，Gleason评分≤7为高、中分化前列腺癌组织即低、中危组。采用Gleason分级法将所有患者分成两组:其中高危组(Gleason评分＞7分)34例，低中危组(Gleason评分≤7分)64例。患者术前均未行放疗、化疗、无非甾体类抗炎药物和糖皮质激素类药物长期治疗史，且都具备完整的临床病理资料。

1.2 方法

1.2.1 试剂来源 采用血小板-内皮细胞黏附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)免疫组化和过碘酸雪夫氏(periodic acidsciff，PAS)组织化学双重染色法，检测前列腺癌组织中VM的形成，采用免疫组织化学SP法检测前列腺癌组织中MMP-2蛋白表达。

即用型兔抗人MMP-2单克隆抗体、S-P试剂盒及DAB显色试剂盒、PSA过碘酸雪夫氏染色剂等全部购自福州迈新公司，并以该公司提供的阳性标准切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照，操作步骤严格按照免疫组化试剂盒说明书进行。

1.2.2 MMP-2阳性表达的判定 光镜下观察免疫组化SP法染色的前列腺癌组织切片，若细胞质内或者细胞膜上出现棕黄色或棕褐色染色颗粒则为MMP-2阳性细胞。高倍镜(×400)下随机选取5个不同视野，分别计算阳性细胞占总细胞的百分数，取其平均值作为此次标本的阳性表达率。阳性细胞数＞25%为阳性表达，≤25%则为阴性表达。

1.2.3 VM结构存在的判定 光镜下观察CD31免疫组织化学染色和PAS组织化学双重染色的前列腺癌组织切片，可见胞质丰富、细胞核大呈不规则形状且核仁明显的异形性肿瘤细胞，有时也可见肿瘤细胞模拟类似血管内皮细胞的首尾相接而排列成腔隙样或网管状的结构。此结构与内皮细胞依赖性血管结构的主要区别是此管壁结构中无CD31阳性表达的梭状血管内皮细胞，但其管腔内可见红细胞，且在红细胞和肿瘤细胞间有时可见PAS阳性连续性或非连续性基膜样结构，此结构即为VM，则判定此标本中有VM的存在，即为VM阳性;若管壁可见CD31阳性的梭状血管内皮细胞和PAS阳性基膜结构，无论管腔内是否有红细胞的存在，均判定为内皮依赖性血管，即为正常血管。

1.3 统计学处理

实验数据均应用SPSS16.0统计软件进行处理分析。计量资料用表示，采用χ2检验和Spearman等级相关分析分析变量VM与MMP-2两者间的关系。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺癌组织中VM结构存在情况

本实验结果表明，98例前列腺癌组织中VM结构存在阳性率为23.5%(23/98)。VM阳性切片中可见由肿瘤细胞变形而成的模拟血管内皮细胞首尾相接而构成的管道样或腔隙样结构，其管壁上无正常血管内皮细胞，管腔内可见有红细胞，但无肿瘤细胞。光镜下VM呈PAS阳性(呈樱桃红色的基膜)且CD31阴性(无棕黄色结构)的管道样结构。VM结构中有时可见肿瘤细胞和红细胞间有一层连续性或不连续性排列的呈樱桃花色的基膜。有时可见某些肿瘤细胞胞质内有CD31阳性表达(棕黄色结构)和PAS阳性表达(樱桃红色)的物质。VM结构周围未见炎性细胞浸润及肿瘤细胞的变性坏死，这提示VM不是癌组织内出血或肿瘤细胞变性坏死而形成的腔隙状结构。本组VM存在阳性组与VM存在阴性组Gleason评分分别为(8.2±0.43)和(6.1 ±0.29)分。本实验结果相关性分析表明，前列腺癌组织中VM的出现与前列腺癌恶性程度具有相关性，且呈正相关性(P ＜0.001，γ =0.487)，见表1。由此可推断VM主要存在于恶性程度相对较高的前列腺癌组织中，VM的存在可能对前列腺癌的发生发展有一定促进作用。VM的形成提示患者预后差。

本实验结构表明，前列腺癌组织中MMP-2表达阳性率为73.5%(72/98)。相关性分析表明MMP-2表达与前列腺癌恶性程度具有相关性，且呈正相关性(P=0.004，γ =0.281)，见表 2。

表1 前列腺癌组织中VM和MMP-2表达的情况(例)

表2 前列腺癌组织中MMP-2表达的情况(例)

2.2 前列腺癌组织中VM与MMP-2表达的相关性

本实验结果表明，前列腺癌组织中VM与MMP-2表达具有相关性，且呈正相关性(P=0.006，γ=0.268)，见表3。结果提示前列腺癌组织中MMP-2的产生可能通过某种作用机制促进肿瘤细胞中VM的形成。

3 讨论

1999年，Maniotis等学者［4］第一次研究发现了一种不依赖于机体正常的血管内皮细胞的全新肿瘤微循环模式，即VM。VM的提出挑战了传统观念认为肿瘤细胞的生长和转移必须以内皮细胞依赖性新生血管形成来保证肿瘤细胞的充足氧供和营养的唯一方式。有些学者则怀疑其是否真实存在，有学者认为这可能是肿瘤组织中出血或者肿瘤细胞因缺血缺氧导致变性坏死后遗留下来的网管状空隙［5］。然而近年来大量研究已经证实了VM的真实存在，且被发现存在于人类多种肿瘤组织中，如人类黑色素瘤［4］、乳腺癌［6］、肺癌［7］、前列腺癌［3］、肝癌［8］、星形胶质细胞瘤［9，10］、颅内血管外皮细胞瘤［11］等，且证实了VM的存在与癌症患者疾病的发生发展和生存预后有关。如El Hallani等［9］报道在星形胶质细胞瘤组织中发现存在着VM结构，且与肿瘤的发生发展存在着一定的联系，对患者的预后不良起到重要的作用，VM的形成预示患者的生存预后差。

本次实验通过对CD31免疫组织化学染色和PAS组织化学双重染色的前列腺癌组织进行观察，结果表明在98例前列腺癌组织中具有VM结构存在的阳性率为23.5%(23/98)。在有VM结构存在的阳性切片中我们可见由肿瘤细胞模拟血管内皮细胞首尾相接而构成的管道样或腔隙样结构，其管壁无正常血管内皮细胞，但管腔内可见有红细胞，且无肿瘤细胞。在光镜下VM呈PAS阳性(呈樱桃红色的基膜)且CD31阴性(无棕黄色结构)的管道样结构。在VM结构中有时可见在肿瘤细胞和红细胞之间有一层连续性或非连续性排列的樱桃花色的基膜样物质。同时在前列腺癌组织细胞中有时可见某些肿瘤细胞的细胞质内表达有CD31阳性(棕黄色结构)和PAS阳性(樱桃红色)的物质。本实验的镜下所见证明了VM确实存在，且是1种有别于内皮依赖性血管结构的独立存在于人类前列腺癌组织中的全新的肿瘤微循环模式。在VM结构的周围并未见到炎性细胞浸润及肿瘤细胞的变性坏死，这提示了VM不是由于癌组织内出血或肿瘤细胞变性坏死而形成的腔隙状结构。其中在本次实验的前列腺癌组织样本中有VM存在的阳性组与无VM存在的阴性组的 Gleason评分分别为(8.2±0.43)分和(6.1±0.29)分。Gleason评分是反映前列腺病理学特征与其生物学行为相关性最好的分级指标，Gleason评分＜7分为低分化前列腺癌组织即高危组，由此可见VM主要存在于恶性程度相对较高的前列腺癌组织中，提示VM的存在可能对前列腺癌的发生发展起到一定的促进作用。同时本实验还证明了MMP-2在人类前列腺癌组织中的表达阳性率与前列腺癌的恶性程度也呈正相关，且VM和MMP-2两者表达呈正相关(P=0.006，γ =0.268)，此结果与 De Cicco 等［12］和 dos Reis等［13］实验研究报道的结果相符合。由此我们可以推断MMP-2的表达可能通过某种信号途径促使VM的形成过程，具体的信号途径及作用机制还有待我们进一步研究探讨。

此次实验揭示了VM与MMP-2两者在前列腺癌临床治疗中具有重要的指导意义。依据传统的新生血管理论抗肿瘤治疗的主要措施是抑制新生血管形成阻断肿瘤增生生长的血供氧供来源。然而在发现有VM存在的肿瘤组织中，抗血管新生的治疗仅仅只能产生癌组织的低氧状态，这种低氧环境有时反而刺激肿瘤细胞通过多条信号通路的传导促进肿瘤的浸润转移或者肿瘤细胞形成VM结构以获得足够的血供。大量文献和本次实验结果都提示，我们在VM存在的情况下单纯的抗血管新生治疗可能毫无意义，要想获得良好的抗肿瘤疗效我们应该考虑联合抗血管新生治疗和抗VM治疗［14］。在治疗肿瘤的过程中同时给予抑制MMP-2表达的药物可减少VM的形成，从而提高抗肿瘤微循环治疗的疗效。

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