枯草芽孢杆菌发酵菌糠制备饲料微生物添加剂的研究

■张丽美 王秀玲 韩梅琳 孙晓红 李 杰

（1.东北农业大学动物营养研究所，黑龙江哈尔滨 150030；2.北京市大兴区农业技术推广站，北京 102611；3.北京农业生物技术研究中心，北京 100097)

菌糠是利用木屑、秸秆等为培养料栽培食用菌后的剩余物。菌糠中约含有粗蛋白9%～13%、粗纤维10%～30%、粗脂肪0.12%～6.2%[1-2]。因其本身适口性差、粗纤维含量较高，影响动物的消化吸收，通常不直接用来制备畜禽饲料,但经某些微生物发酵后，可用于制备微生物饲料添加剂，进而改善饲料品质。枯草芽孢杆菌具有很高的蛋白酶、淀粉酶的活性，并能明显提高动物生长速度和饲料利用率，其芽孢的营养体细胞易保存，存活率高，因此通常选用枯草芽孢杆菌作为微生物饲料添加剂发酵菌种[3-4]。目前，国内的研究主要采用液体发酵法，国外的研究主要集中在固体发酵法[5-7]。很多研究表明，固体发酵稳定性好[8-9]，且设备比较简单；同时固体发酵有利于提高产酶活力。在国内，利用枯草芽孢杆菌发酵菌糠的研究报道甚少。本试验用枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌糠生产微生物饲料添加剂，以期为菌糠再利用提供技术参数和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

试验所用枯草芽孢杆菌菌种由国家粮食局动物营养研究所提供。

1.1.2 培养基

活化培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、蒸馏水1 000 ml，pH值为7.0。

计数培养基：LB培养基，pH值为7.4。

1.1.3 菌糠

试验所用金针菇菌糠由北京市房山区格瑞拓扑生物科技有限公司提供。

1.2 发酵方法

1.2.1 菌种活化及菌糠成分测定

将活化培养基分装于500 ml锥形瓶中，每瓶装100 ml，用封口膜封好，0.1 MPa、121 ℃高压灭菌20 min；将2环斜面菌种接入活化培养基中，然后置于37℃、200 r/min恒温、恒湿摇床中培养72 h，作为种子备用。

试验前期对菌糠营养成分进行了测定，结果见表1。由表1可知，菌糠中的C/N为34.6∶1，较微生物生长的最适C/N（25∶1）偏高，本试验拟以添加一定量的氮源对C/N进行调整。

表1 发酵所用菌糠各成分含量

1.2.2 外源氮水平的选取

选取尿素、硫酸铵、棉粕、麦麸4种常用氮源，分别进行氮源添加量对菌糠发酵物中芽孢数的影响试验，来确定5因素4水平L16（45）正交试验（试验设计见表2）不同氮源的适宜添加量。

表2 正交试验因素与水平设计

1.2.3 菌糠固体发酵试验设计

试验采用5因素4水平正交设计，优化金针菇菌糠的发酵条件[10-11]。取40 g菌糠和一定量的氮源（依据1.2.2所得外源氮水平）装入三角瓶中混匀，于121℃高压蒸汽灭菌20 min,出锅冷却至35℃左右加入60 ml蒸馏水及一定量的枯草芽孢杆菌菌液（依据表2中规定的接种量，菌数为9×106cfu/ml），在恒温培养箱中培养[12-14]。

1.2.4 测定指标及方法

芽孢数测定采用普通平板计数法;粗蛋白测定采用GB/T 6432—1994中方法；粗纤维测定采用GB/T 6433—2006中方法；粗脂肪测定采用GB/T 6434—2006中方法；还原糖测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法。游离棉酚测定采用GB13086—91中方法。

2 结果

2.1 外源氮水平选取

2.1.1 尿素水平选取

设定尿素的添加量分别为0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和1.25%，不同添加量时菌糠发酵产物中枯草芽孢杆菌的芽孢数变化见图1。由图1可知，尿素水平在0.25%到0.50%之间，活菌数量随着尿素水平的增加而提高；尿素添加量为0.50%时芽孢数最多，尿素水平超过0.50%，芽孢数随着尿素水平的增加而降低。由此选0.50%尿素为5因素4水平L16（45）正交试验中外源氮尿素的水平。

2.1.2 硫酸铵水平选取

设定硫酸铵的添加量分别为1.00%、1.50%、2.00%、2.50%和3.00%，不同添加量时菌糠发酵产物中枯草芽孢杆菌的芽孢数变化见图2。由图2可知，硫酸铵水平在1.00%到1.50%之间，芽孢数量随着硫酸铵水平的增加而提高，硫酸铵添加量为1.50%时，芽孢数最多；硫酸铵水平超过1.50%，活菌数量随着硫酸铵水平的增加而降低。由此选1.50%硫酸铵为5因素4水平L16（45）正交试验中外源氮硫酸铵的水平。

图1 添加不同水平的尿素对菌糠发酵物中芽孢数的影响

图2 添加不同水平的硫酸铵对菌糠发酵物中芽孢数的影响

2.1.3 棉粕水平选取

设定棉粕的添加量分别为1.00%、2.00%、3.00%、4.00%和5.00%，不同添加量时菌糠发酵产物中枯草芽孢杆菌的芽孢数变化见图3。由图3可知，棉粕水平在1.00%到3.00%之间，活菌数量随着棉粕水平的增加而提高；棉粕水平超过3.00%，活菌数量随着棉粕水平的增加而降低。棉粕添加量为3%时芽孢数最多，由此选3%棉粕为5因素4水平L16（45）正交试验中外源氮棉粕的水平。

2.1.4 麦麸水平选取

设定麦麸的添加量分别为2.00%、3.00%、4.00%、5.00%和6.00%，不同添加量的菌糠发酵产物中枯草芽孢杆菌的芽孢数变化见图4。由图4可知，麦麸水平在2.0%～4.0%之间，活菌数量随着麦麸水平的增加而提高，麦麸添加量为4.0%时芽孢数最多；麦麸水平超过4.0%，活菌数量随着麦麸水平的增加而降低。由此选4.0%麦麸添加量为5因素4水平L16(45)正交试验中外源氮麦麸的水平。

图3 添加不同水平棉粕对菌糠发酵物中芽孢数的影响

图4 添加不同水平麦麸对菌糠发酵物中芽孢数的影响

2.2 固体发酵最适宜条件的研究

本试验依据图1～图4所选定的氮源水平，采用L16（45）的正交试验表(见表2)进行固态发酵[15-17]，分析培养温度、外源氮水平、初始pH值、发酵时间和菌液接种量等因素对芽孢数的影响，从而确定固体发酵的最佳条件，结果见表3。在最适条件下发酵金针菇菌糠,对发酵前、后菌糠中游离棉酚的含量以及发酵后的菌数进行测定,结果见表4。

由表3固体发酵的正交试验结果进行分析,可知RB＞RC＞RD＞RE＞RA，即外源氮的影响最大，为主要因素，其次是初始pH值和发酵时间，培养温度影响较小，此正交试验的最优条件为B3C4D2E4A3，即外源氮棉粕3%的添加量，初始pH值为7.5，发酵终止时间48 h，菌液接种量10%，培养温度35℃。

由表4可得，在此最适条件下发酵金针菇菌糠，测得发酵后产品中芽孢数为8×109cfu/g（干重），达到国家农业行业标准的要求（NY/T1461—2007）；游离棉酚含量由发酵前的76.78 mg/kg降至发酵后30.68 mg/kg,降解率达到60.04%。

表3 正交试验不同条件下测得的芽孢数

表4 最适条件下发酵产物中芽孢数和游离棉酚降解程度

2.3 发酵产物的卫生指标及营养成分的测定

对其发酵后产品在45℃下烘干制得微生物制剂。最后，对此制剂中的黄曲霉毒素B1、砷、铅、汞、镉等成分进行测定,具体结果见表5。

表5 发酵产物的卫生指标的测定结果

根据国家饲料卫生标准（GB 13078—2001）的规定，菌糠发酵物中黄曲霉毒素B1以及重金属镉、砷、铅、汞的成分均符合国家饲料卫生标准，并含有少量粗蛋白、粗脂肪等营养成分。

3 讨论

3.1 枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌糠的最适条件

枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌糠的最适条件为B3C4D2E4A3，即棉粕添加量3%，初始pH值7.5,发酵时间48 h，菌液接种量10%,发酵温度35℃。在此最适条件下利用枯草芽孢杆菌发酵金针菇菌糠，测得发酵后产品中芽孢数为8×109cfu/g（干重），达到国家农业行业标准的要求（NY/T1461—2007）。

3.2 发酵过程中游离棉酚含量变化

与发酵前相比，游离棉酚的降解率达到60.04%；游离棉酚含量的下降说明微生物同样具有降解游离棉酚的能力，作为发酵原料的菌糠来源广、成本低廉，用来制备饲料微生物添加剂，可降低饲料成本[18]。

3.3 菌种特异性对发酵结果的影响

在枯草芽孢杆菌的固体发酵过程中，初始pH值、菌液接种量、培养温度、发酵时间、氮源种类及其水平都会影响发酵产物中的芽孢数[19]。本试验结果的最适pH值和最适温度分别为7.5和35℃，与报道的研究结果（pH值8和32℃）[20-21]有一定差异，其原因可能是pH值和温度存在菌株特异性。试验结果表明，利用枯草芽孢杆菌发酵菌糠制备饲料添加剂是可行的，不仅对延长生态链、促进农业可持续发展具有重要的意义，而且利用菌糠替代其他发酵原料可以降低饲料成本，缓解饲料不足的压力，提高养殖经济效益。

4 结论

①枯草芽孢杆菌的最适发酵条件为B3C4D2E4A3，即棉粕添加量3%，初始pH值7.5，发酵时间48 h，菌液接种量10%,发酵温度35℃。

②在此最优条件下发酵金针菇菌糠,测得其发酵后芽孢数为8×109cfu/g（干重）。

③游离棉酚含量由发酵前的76.78 mg/kg降至发酵后30.68 mg/kg,降解率达到60.04%。

④发酵后的产物经烘干后，其黄曲霉毒素B1以及重金属镉、砷、铅、汞的含量均符合国家饲料卫生标准（GB 13078—2001）。