锌对不同动物金属硫蛋白表达的影响

■ 刘婉盈邓 波 徐子伟 李 伟,3

（1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004；2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州 310021；3.南京农业大学动物科技学院，江苏南京 210095）

锌是动物所必需的微量元素之一，动物体内适宜的锌水平对维持动物的生长、发育和免疫功能起着非常重要的作用。对畜牧生产来说，如果饲料中不添加额外的锌，动物很可能发生原发性和继发性缺锌。缺锌将导致细胞免疫损伤、DNA氧化损伤、线粒体功能紊乱，最重要的是导致细胞过早老化。研究发现，锌与金属硫蛋白之间存在密切的联系，主要是锌可以直接调控金属硫蛋白基因的表达，而金属硫蛋白直接调节体内锌的吸收和代谢，维持体内锌的内稳态。动物体内金属硫蛋白（Metallothionein,MT）含量偏低，将使得细胞对凋亡因子更敏感，这说明MT影响信号通路来调节细胞凋亡，也间接说明锌对体内新陈代谢和细胞凋亡的影响。因此本文综述了MT与锌代谢的关系和锌对不同动物金属硫蛋白表达的影响，为深入了解锌的作用提供参考。

1 金属硫蛋白

1957年，由Margoshes和Vallee在马肾皮质中首次分离出了金属硫蛋白（Metallothionein,MT）。MT是一种富含半胱氨酸、低分子量的蛋白质，它与锌和其它重金属有较强的亲和力，可以由很多因素诱导产生。研究发现，脊椎动物的MT基因有一个或者多个同源序列，不同的动物含有的MT同源基因的数量并不一致。同一个种属，不同动物的MT基因也不同，如鸡、鸭、火鸡等，拥有相同的MT基因，而鸟属中的鸽子、鹌鹑就分别拥有两个MT同源基因。不同功能的同源基因翻译出不同的蛋白亚型(MT异构体)。哺乳动物的MT有4种异构体：MT-1、MT-2、MT-3和MT-4。其中MT-1和MT-2在动物的肝脏、胰脏、肾脏和小肠等组织中表达丰富；MT-3主要存在于中枢神经系统，MT-4主要分布在皮肤、舌、消化道等的角质细胞和复层鳞状上皮细胞中。哺乳动物金属硫蛋白一般由61～68个氨基酸组成，含有21个半胱氨酸残基，其三级结构式由α和β两个球状金属结构域组成。MT在细胞代谢中涉及多种功能，如：转运、储存金属离子、解毒金属离子富集产生的细胞毒害作用、离子的体内平衡、自由基清除、免疫应答和对抗疾病。

2 MT与锌代谢的关系

MT结合某些金属离子，因此，避免了金属离子的毒性。如果体内自由锌离子浓度提高，就会导致蛋白质的错折叠，并且通过对线粒体的作用产生细胞毒性，引起氧化应激。

无金属结合的MT称为硫蛋白(thionein)，其高级结构为无序结构，但一旦结合金属离子，就会改变构象，折叠成有序的结构。在细胞内不同位置均发现MT的存在，MT涉及从细胞质转运锌离子至细胞核内，用于细胞增殖，或者使锌离子转运至线粒体的膜间隙，用于调节呼吸作用。MT同时也存在于细胞外间隙中，细胞通过内吞途径，使携带着金属离子的MT进入细胞质。MT可调控锌的自稳态，而体内摄入的锌也影响组织中MT的含量。

锌及其蛋白质配体的相互作用取决于MT中半胱氨酸的硫基，MT以Zn3S9和Zn4S11两个结构域结合锌。然而，对锌的亲和力而言，不同结合部位相差很大的数量级。7个锌离子与巯基的结合力是不同的，其中4个锌离子结合力最强(logK=11.8)，2个锌离子结合力偏弱(logK≈10)，1个锌离子结合力最弱(logK=7.7)，这个发现说明结合MT的锌具有动力学不稳定性。MT对锌代谢的影响是通过半胱氨酸巯基可逆的氧化还原反应释放或者结合锌离子来调节的，所以MT起到了缓冲体内锌的能力，使体内自由锌浓度在一个稳定范围内，而其他含锌蛋白由于锌在体内总是以二价形式存在，氧化还原能力不活泼。在对锌的吸收利用上，有研究证明，MT和另一种含巯基的蛋白CRIP（半胱氨酸丰富蛋白）共同负责结合肠道中的锌，调节锌的吸收，小肠MT的水平与锌的吸收呈明显的反比关系。

3 锌对不同动物MT表达的影响

研究发现，锌可影响肠道和肝脏中基因的表达，促进生长。金属硫蛋白(MT)具有促进细胞生长、发育的功能。在肠道黏膜细胞中，锌的吸收受MT的调节，而日粮锌浓度可以刺激肠道和肝脏中MT-mRNA的表达。MT与肠细胞内锌结合配体相竞争，控制着跨基膜转运入循环系统中锌的数量。日粮锌浓度升高，则各组织器官中MT浓度也随之升高，其调控机理可能是通过第二信使转导实现的，锌与金属反应元件转录因子(MTF)结合，识别MT基因启动子上的特异序列金属反应元件(MRE)，并结合到DNA序列上，从而启动转录。有研究发现，在鸡饲料中添加锌可以使鸡肝Zn和Zn-MT含量明显增加，这说明鸡体内Zn的储备主要是通过Zn-MT的形式实现的。Carlson等推测肠细胞内锌的增加和MT一起可能有利于蛋白质的合成和细胞的分裂增殖，从而促进肠道健康，促进动物生长。锌对不同动物和不同组织MT及MT-mRNA表达的诱导能力不同，下面分别介绍不同动物受锌诱导组织中MT表达受到的影响。

3.1 锌对家禽MT表达的影响

黎云等采用RT-PCR(引物设计见表1)方法研究两种锌源对艾维茵肉仔鸡肝脏MT-mRNA基因表达的影响，结果表明，日粮中添加60 mg/kg的硫酸锌和氨基酸络合锌均能提高肉仔鸡肝脏MT-mRNA的丰度，但与硫酸锌相比，日粮中添加氨基酸锌显著提高了肝脏MT-mRNA基因表达的水平(P＜0.05)。

表1 家禽MT和内参基因的上下游引物序列

李发弟等也采用了RT-PCR方法（引物设计见表1）检测不同锌添加水平对蛋鸡肝脏和肾脏中MT-mRNA表达水平的影响。结果表明：基础饲粮中添加60 mg/kg锌可显著提高成年蛋鸡肝脏中MT基因的表达水平，而对肾脏中MT-mRNA的表达无显著性影响，提示锌调节组织中MT的基因表达和蛋白合成并呈现一定的剂量依赖性关系，且其影响具有组织特异性。丁小波等研究发现，含锌40、60 mg/kg的纳米氧化锌组能显著提高肝脏中MT的生成量(P＜0.05)。以上试验说明硫酸锌或氨基酸络合锌的添加量为60 mg/kg时，能有效地提高鸡机体金属硫蛋白的表达。

3.2 锌对哺乳动物MT表达的影响

徐振华等报道，分别以硫酸锌和蛋氨酸锌形式添加40、80、120 mg/kg锌对2～3月龄生长肉兔金属硫蛋白表达（引物设计见表2）的影响，随着日粮锌水平的增加，肝脏、肾脏MT-1mRNA相对表达丰度呈先升高后降低趋势，且80 mg/kg添加水平时两种锌源MT-1mRNA相对表达丰度均达到最高。

表2 哺乳动物MT和内参基因的上下游引物序列

许梓荣等发现，饲粮中添加3 000 mg/kg锌(氧化锌)，显著提高了仔猪肝脏组织中MT的含量，其中3 000 mg/kg锌(氧化锌)组肝脏MT含量是对照组(100 mg/kg)的13倍。Lopez-Alonson等研究了镉、铜、锌对猪肝脏和肾脏金属硫蛋白表达能力的影响，结果表明，不管是肝脏还是肾脏，MT的表达都取决于锌的水平，虽然人们普遍认为铜和镉比锌有更强的结合MT的能力，但是试验结果却是在肝脏中随着MT浓度的增高，MT结合铜和镉的比例逐渐下降，也就是说MT结合铜和镉的比例直接取决于锌。故用金属硫蛋白来评价猪体内锌营养水平是比较准确的。笔者采用RT-PCR法（引物设计见表2）检测了不同锌源及锌水平对猪肝脏金属硫蛋白的影响(未发表)，发现80 mg/kg添加水平MT-mRNA相对表达丰度最高，与徐振华等在肉兔上的试验结果类似。

Vicki等研究了给年轻人补充锌对单核细胞和红细胞中金属硫蛋白表达的影响（引物设计见表2），在18 d内给年轻人每天补充50 mg的锌，参照为空白对照，试验结果表明，在补充锌8 d后，红细胞中金属硫蛋白含量显著高于对照组，补充锌2 d后单核细胞中金属硫蛋白mRNA的水平显著高于对照组，在18 d以后，不管是单核细胞还是红细胞，加锌组金属硫蛋白的表达都相应地提高。而加锌组的血浆锌含量在结束补锌后的6 d内仍比对照组高，直到22 d后，加锌组血浆锌水平才降到对照组的水平。此试验表明，单核细胞金属硫蛋白mRNA和红细胞内金属硫蛋白含量均能反映摄取锌的水平，并且单核细胞金属硫蛋白mRNA对锌水平的反应速度要比红细胞金属硫蛋白快。Sullivan等用竞争性反转录PCR法测定了单核细胞内MT-mRNA水平，指出单核细胞MT-mRNA评定Zn代谢状况要比血浆Zn更有意义。

4 研究展望

动物体内适宜的锌水平对生物体的生长发育、免疫、抗应激及物质代谢等多方面起着非常重要的作用，故给动物日粮中补充锌是非常有必要的，但是添加量的多少，则可以通过金属硫蛋白的表达进行评定，若通过组织锌或者血浆锌来评定锌的添加量，则可能已经超过动物所需的量，并且反应存在很大的迟缓。由于锌诱导金属硫蛋白的表达在不同动物、不同组织中受到的影响存在差异，所以要更加准确的用金属硫蛋白来评定动物体内锌的营养状况，应就不同动物选取此动物受影响最为敏感的组织作为试验材料。

（参考文献29篇，刊略，需者可函索）