微生物对肉鸭肝脏及肌肉中黄曲霉毒素B1残留的影响

■宋文静 Latifa Rizka Fidaroin 齐德生 张妮娅

（华中农业大学动物科技学院饲料与饲料生物技术实验室，湖北武汉 430070）

黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）广泛存在于花生、玉米、大米等谷物中，是自然界中已经发现的理化性质最为稳定的一类霉菌毒素，其中AFB1毒性最强。AFB1被动物摄食后，可以通过血液循环在动物的血液、肝脏、肌肉等可食组织中残留，进而通过食物链危害人类健康，并可与乙肝病毒协同导致肝癌发病率上升[1]。因此，对AFT脱毒是保证食品卫生安全的重要措施。目前AFT的脱毒方法主要有：物理吸附法、化学法、生物法等。物理法局限性在于成本高，去毒不彻底，经过处理的食物保存时间短，易产生二次污染；化学法局限性在于成本高，去毒不彻底，营养成分损失严重。相对于这两种方法，微生物法能够在温和的条件下去除霉菌毒素，而不影响日粮的营养价值和适口性[2-4]。基于微生物法脱毒的诸多优势，人们已经做了大量体内和体外试验研究。然而关于微生物脱毒的动物试验，大部分停留在对动物生长性能和对健康影响的研究。AFB1不仅可以影响动物生长性能和健康[5-6]，而且可以在动物组织中残留[7-8]，而目前尚未有微生物对肝脏、肌肉中AFB1残留影响的报道。本试验就是基于微生物法，通过在肉鸭日粮中添加微生物研究其对AFB1在鸭肝脏、肌肉中残留的影响，为生产实践和食品安全提供一定的理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

枯草芽孢杆菌：有效活菌数为2×1011CFU/g；地衣芽孢杆菌：有效活菌数为1×1011CFU/g；粪链球菌：有效活菌数为5×109CFU/g；酵母：有效活菌数为2×1010CFU/g；丁羟甲苯（东化成工业株式会社）；AFB1：纯度≥99%（Sigma公司）。

AFB1标准储备液（10 μg/ml）：准确称取适量的AFB1标准品，用色谱纯乙腈将其溶解配制成10 μg/ml的标准储备液，于4℃冰箱内存储。

AFB1标准工作液：准确吸取适量的标准储备液，用色谱纯乙腈逐级稀释，得到浓度分别为0.5、1、2、4 ng/ml的系列标准工作液。

1.2 试验仪器

Agilent1200型液相系统：四元低压梯度泵、自动进样器、恒温柱温箱、真空脱气机、荧光检测器、二级管阵列检测器；玻璃匀浆机；离心机；分析天平：感量0.000 1 g；微孔过滤膜：0.45 μm，水系、油系；旋涡混合器；超声波清洗器；空气泵；恒温水浴锅。

1.3 色谱条件

色谱柱：型号sinochrom ODS-BP，规格C8 4.6×250 mm，粒径5 μm；流动相：甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶2(v/v/v)；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：50 μl；检测波长：Ex为360 nm，Em为440 nm。

1.4 AFB1标准工作液分析步骤

取AFB1的标准工作液1 ml到棕色具塞小瓶中，用空气泵吹干（60℃吹干，注意不要使液体鼓泡、飞溅）。加入200 μl正己烷和100 μl三氟乙酸，密闭混匀30 s后，在(40±1)℃烘箱中衍生15 min。取出衍生后的样品溶液，在60℃条件下用空气泵吹干，用1 ml流动相定容至1 ml，用0.45 μm的微孔过滤膜过滤，待上机测定。

1.5 试验动物分组及日粮配制

1日龄的樱桃谷肉鸭，基础日粮育雏，适应环境1周后，随机选取192只健康、体重相近的雏鸭，随机分为6个组，每组4个重复，每个重复8只鸭。具体分组见表1。基础日粮参考NRC(1994)肉鸭营养需要量配制，基础日粮组成及营养水平见表2。

表1 试验日粮

表2 基础日粮组成及营养水平（风干基础）

1.6 饲养管理

饲养试验于2011年10月28日至2011年12月16日在华中农业大学饲料检测站营养代谢实验室进行。

试验前1周将鸭舍鸭笼进行彻底清扫冲洗、消毒。试验鸭采用笼养，自由采食和饮水。预试期1周，正试期6周，分两阶段进行,第一阶段为第2～4周；第二阶段为第5～7周。

1.7 试验样品的采集和处理

樱桃谷肉鸭在42日龄屠宰、采样。采样前禁食(自由饮水)24 h。肝脏样品：将肝脏全部取出，装于样品封口袋中，立即放入-20℃冰箱中保存，分析测定其中AFB1残留量；肌肉样品：将右侧胸肌、腿肌全部剥离，装于样品封口袋中，立即放入-20℃冰箱中保存，分析测定其中AFB1残留量。

1.8 肝脏、肌肉中AFB1残留测定

样品前处理方法参照参考文献[9]：准确称取肝脏和肌肉样品各4 g，用研钵研磨后，与0.2 ml的20%柠檬酸水溶液和0.4 g硅藻土完全混合，加入4 ml二氯甲烷提取，在室温下振荡30 min过滤，加入0.1 g无水硫酸钠，再次过滤，用空气泵吹干，加入200 μl正己烷和100 μl三氟乙酸，避光密闭混匀30 s后，在（40±1）℃烘箱中衍生15 min。取出衍生后溶液，在60℃条件下用空气泵吹干，再用 500 μl流动相定容至 500 μl，在0.45 μm的微孔过滤膜中过滤，最后用高效液相色谱仪检测。

2 结果

用高效液相色谱法测得AFB1在6个组的肝脏、肌肉中残留结果如表3。污染组的肌肉和肝脏中检测出AFB1的残留，肝脏中残留量为(0.16±0.027)ng/g，肌肉中残留量为(0.022±0.009)ng/g，其它组肝脏和肌肉中均未检出AFB1残留。图1所示为4 ng/ml的AFB1标准品在1.3的色谱条件下的峰形图，此峰基线平稳，峰形呈正态分布，略有前倾现象，无拖尾和分叉现象，保留时间为5.707 min。在污染组肝脏中测得AFB1图谱如图2，在污染组肌肉中测得AFB1图谱如图3。在处理组1～4肝脏、肌肉中测定的图谱见图4和图5，在对应的保留时间无AFB1的峰形出现。由于每次测定受流动相和色谱柱等的影响保留时间略有差异，测定前采用标准品比对可判定AFB1的峰形。

表3 AFB1在肝脏、肌肉中的残留

图1 4 ng/ml AFB1标准品图谱

图2 AFB1肝脏样品图谱（污染组，第7周）

图3 AFB1肌肉样品图谱（污染组，第7周）

图4 处理组肝脏样品图谱（处理组，第7周）

图5 处理组肌肉样品图谱（处理组，第7周）

3 讨论

AFB1的理化性质稳定，会在动物血液、组织中存在，并且通过食物链对人类健康造成危害[10-12]。研究表明，在基础日粮中添加100 μg/kg AFB1，持续饲喂肉鸡42 d，在血液和肝脏中残留量分别为0.051 ng/g和 20.86 ng/g[7]。Zahid Hussain 用含有0、1 600、3 200、6 400 ng/g AFB1的日粮持续饲喂肉鸡 7 d，肝脏中 AFB1残留量分别为 0、（3.65±0.09）、（3.26±0.23）、（6.59±0.23）ng/g，肌肉中AFB1残留量分别为0、（0.49±0.05）、（0.77±0.01）、（2.18±0.00）ng/g[8]。本试验在此基础上研究低剂量AFB1在肝脏和肌肉组织中残留量，结果表明：日粮中低剂量AFB1被动物摄食后，在肝脏和肌肉中有一定程度的蓄积，其中肝脏中残留量较肌肉中多，这与肝脏是AFB1的靶器官有关。

很多微生物包括细菌、酵母菌、霉菌、放线菌和藻类都能够去除或降解饲料中的AFT[13]。微生物通过非共价键与AFT形成AFT-菌体复合体，形成复合体后，微生物自身的吸附能力下降，与AFT一起排出体外，从而降低AFT的危害[14]。刘畅等通过对菌体处理方式和吸附时间的优化，可使酿酒酵母Y1对AFB1的吸附率达81.16%[15]。此外，枯草芽孢杆菌[16]、链球菌[17]、酵母[18]、乳酸菌[19]、醋酸菌等降解AFT的能力都较强。本试验研究表明：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌均可降低低剂量AFB1在肝脏、肌肉中的残留。其吸附量、降低残留程度去毒机理将是今后的研究方向。

4 结论

①AFB1可在鸭的肝脏和肌肉中残留。本试验污染组日粮中AFB1的含量分别为10 ng/g(2～4 W)和20 ng/g（5～7 W）条件下，7周后在肉鸭肝脏和肌肉中 AFB1残留量分别为（0.16±0.027）、（0.022±0.009）ng/g。

②微生物可以有效减少AFB1在肝脏、肌肉中的残留。本试验在日粮中添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌均可有效降低AFB1在肝脏、肌肉中的残留。