噬菌体疗法在耐药性细菌感染中应用的研究进展

李菁华，孙延波

（吉林大学白求恩医学院病原生物学系，吉林 长春 130021）

细菌的耐药性已经成为全球医学领域关注的焦点，特别是“超级细菌”的频频出现，使人类重新步入“前抗生素”时代的可能性正成为现实。2010年8月英国和印度学者［1］发现一种携带NDM－1耐药基因的新型“超级细菌”，这种细菌能够对包括广谱抗生素碳青霉烯类在内的几乎所有抗生素产生耐药性。2010年10月中国疾病预防控制中心和中国军事医学科学院［2］同时宣布在中国内地的宁夏和福建均发现了这种“超级细菌”。2010年中国CHINET细菌耐药性检测网对国内不同地区14所教学医院临床分离菌进行药物敏感试验［3］的结果显示：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin－resistant staphylococcus aureus，MRSA）的检出率为51.7%，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌的检出率为71.6%，大肠埃希菌、肺炎克雷白菌和变形杆菌产超广谱β－内酰胺酶（ESBLS）的检出率分别为 56.2%、43.6%和5.5%。耐药菌株的日益增多，抗生素已无法达到理想的治疗效果，而噬菌体作为一种传统的抗菌疗法又重新受到关注。近些年来，欧美国家的一些学者陆续发表了有关噬菌体抗菌技术的专稿，就噬菌体的基础性研究和开发予以积极评价，认为噬菌体的天然靶向作用、抗菌的专一性和高效性及其相关研究为传染病控制开创了新的领域，特别是针对耐药性细菌的噬菌体疗法具有重要的临床意义。

1 噬菌体的生物学特性

噬菌体是侵袭细菌的病毒，最早由英国细菌学家Twort［4］及法籍－加拿大微生物学家d’Herelle［5］分 别 于1915和1917年发现。Brussow等［6］研究显示：自然界中约有1032个噬菌体存在，这个数目是细菌数量的十余倍。噬菌体在其生活周期过程中呈现2种类型，即毒性噬菌体和温和噬菌体。毒性噬菌体能使宿主菌细胞迅速地裂解死亡，而温和噬菌体在感染宿主菌后一般不引起宿主菌立即死亡，而是将自身的基因组整合至宿主菌的染色质中，这种状态又叫做溶原状态。因此，用于治疗和控制细菌性感染的噬菌体主要是指毒性噬菌体。噬菌体在侵袭细菌的过程中表现出很独特的专一性，这主要体现在2个方面：一是噬菌体主要侵袭细菌，而对哺乳类动物细胞无任何影响；二是每种噬菌体只能侵袭某种特定的细菌，例如，能侵袭大肠埃希菌的噬菌体对其他细菌如葡萄球菌、变形杆菌等则无任何作用。此外，噬菌体裂解细菌的效率非常高，噬菌体感染细菌后，通过异常特殊机制，噬菌体DNA进入菌细胞，随后进行生物合成，产生大量子代噬菌体，子代噬菌体从细胞内释放至细胞外，宿主细胞随即死亡。超过100个子代噬菌体从每个菌细胞中释放出来，而每个噬菌体又可以感染新的菌细胞，因此噬菌体裂解细菌的效能非常惊人。

2 噬菌体疗法的动物实验和临床应用

2.1 噬菌体用于动物细菌感染的初步研究 d’Herelle［5］最初开展噬菌体疗法是在动物性疾病模型中进行，其首先将噬菌体用于禽类伤寒的实验中，结果发现：接受噬菌体治疗的动物对鸡沙门菌（Salmonella gallinarum）的感染有很好的保护作用。此外，d’Herelle又采用噬菌体治疗由出血败血症性巴斯德菌（Pasteurella multocida）所致牛出血性败血症，同样取得良好的效果。由于在动物的消化道感染和败血症治疗中取得进展，d’Herelle决定将这一方法应用于人类疾病，其从痢疾患者的排泄物中分离并纯化痢疾杆菌噬菌体，为了确保安全性，其与助手首先口服这种噬菌体制剂，然后用于治疗痢疾患者。20世纪20年代利用噬菌体治愈鼠疫患者［8］在欧洲引起轰动，d’Herelle在埃及发现4名鼠疫患者，将噬菌体注射至患者的腹股沟淋巴结后4名鼠疫患者奇迹般地恢复。此后的十几年中，由于当时的技术条件的限制以及产品质量标准的问题，噬菌体疗法进展缓慢。二战结束后抗生素的发现和大规模生产及应用，基本解决了细菌性感染的问题。因此，西欧和美国学者［9］几乎完全放弃了噬菌体的研究。但是，前苏联和东欧一些国家的科学家未受到西欧和美国科学界对噬菌体疗法放弃的影响，仍然对噬菌体的抗感染作用进行深入的研究。波兰的Hieszfeld研究所和前苏联格鲁吉亚共和国的Eliava研究院进行了一项研究［10］，于1981—1986年组织十几个科学部门，对噬菌体疗法的效果进行系统的临床观察，患者包括1周龄的婴儿到86岁的老年人，主要针对抗生素治疗失败的患者，疾病的种类包括持久不愈的脓漏、细菌性败血症、脓肿、呼吸道化脓性感染、支气管肺炎、尿道感染和化脓性腹膜炎，或用于术后和外伤感染的预防及治疗。治疗评价指标包括症状的改善、局部伤口愈合和致病菌的消除等，其成功率为75%～100%（平均治疗成功率为92%）。

20世纪80年代英国学者Smith等［11］开始进行一些动物实验以证实噬菌体治疗的效果和安全性，其以噬菌体治疗具有荚膜多糖抗原细菌引起感染的实验结果显示：噬菌体的治疗效果明显高于四环素、链霉素、青霉素和磺胺类药物，且利用噬菌体治疗小牛腹泻取得了较好的保护效果。Soothill等［12］以豚鼠为模型研究噬菌体对烧伤后铜绿假单胞菌感染的治疗效果，并证实如在烧伤植皮前用噬菌体进行预处理，可预防移植排斥反应。Cerveny等［13］通过皮下注射弧菌建立小鼠全身感染和局部感染的动物模，结果显示：静脉注射噬菌体治疗能明显提高小鼠的存活率，且能减轻小鼠全身和局部感染。Chibani－Chennoufi的研究小组［14］从环境和幼儿腹泻患者中分离出4株具有宽泛感染能力的大肠埃希菌噬菌体，进一步的研究显示：这些噬菌体对腹泻相关大肠埃希菌的不同血清型具有明显的裂解作用。将这些噬菌体放入动物的饮用水中，从动物的排泄物中能分离出具有同样生物学特性的噬菌体，同时动物体内耐氨苄青霉素大肠埃希菌已被裂解，并且动物的肠黏膜无任何病理学改变。因此推测：动物使用噬菌体后，噬菌体可在动物群中扩散，这对进一步的群体细菌感染可起到预防作用。

2.2 噬菌体用于革兰阳性耐药菌感染的研究 MRSA自上世纪60年代就已被发现［15］，而目前在医院内分离的金黄色葡萄球菌绝大多数均是MRSA［16］，MRSA是“超级细菌”成员之一，可引起各种类型的化脓性感染，只有万古霉素能控制感染。利用噬菌体治疗由MRSA所致动物感染已有相关的报道。O’Flashery等［17］利用金黄色葡萄球菌噬菌体K对从医院分离的36株MRSA和2株耐万古霉素的金黄色葡萄球菌进行了分析，其中噬菌体K能裂解20株MRSA和2株耐万古霉素的金黄色葡萄球菌。Matsuzaki等［18］在MRSA引起的小鼠感染实验中，将8×108CFU·mL－1MRSA注射至小鼠体内，同时进行噬菌体ΦMR11（感染复数为50）治疗，结果显示：未经噬菌体治疗的小鼠7d死亡率大于90%。细菌生物膜的形成对抗生素的疗效也会产生严重的影响。Sass等［19］利用分子克隆技术获得噬菌体Φ11编码的裂解酶（endolysin），如果将该裂解酶加入到处于对数生长期的具有生物膜的金黄色葡萄球菌（NCTC8325）和表皮葡萄球菌（O－47）培养液中，细菌的数量在20min内下降60%。耐万古霉素肠球菌（Vancomycin－resistant enterococci，VRE）是“超级细菌”的另一重要成员，于1989年在美国、法国和英国首次被发现，美国医院内感染监测系统报告［20］显示：20%的肠球菌分离株均呈现对万古霉素的耐药性。VRE感染对艾滋病（AIDS）患者、癌症患者、器官移植和老年患者极易造成死亡。因此，积极预防VRE感染是当前全球面临的重要公共卫生问题［21］。位于美国马里兰州的Exponential Biotherapies公司利用噬菌体治疗由VRE引起的动物菌血症的研究［22］显示：以致死量的 VRE（109CFU·mL－1）腔内注射，48h后动物全部死亡。如果在感染后的45min，仅给予一次性噬菌体治疗（3×108PFU·mL－1），动物的存活率为100%。如果在感染后24h给予噬菌体治疗，动物的存活率约为50%。

2.3 噬菌体用于革兰阴性耐药菌感染的研究 革兰阴性杆菌是构成医院内感染的重要病原体，包括肠杆菌科的大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。临床常见的产超广谱酶大肠埃希菌、多重耐药的铜绿假单胞菌、泛耐药肺炎克雷伯杆菌和近年发现携带NDM－1耐药基因的革兰阴性杆菌均属于“超级细菌”［23］。“超级细菌”的存在及其家族新成员的不断出现已引起国际社会的高度关注。面对当前细菌耐药性的紧迫性，相关权威学术机构正积极应对，包括积极寻找新的靶向药物和新的抗菌疗法。Wang等［24］采用耐亚胺培南铜绿假单胞菌感染动物的研究显示：以细菌的最小致死量（3×107CFU·mL－1）注射小鼠腹腔后，动物在24h内全部死亡，如果在感染后15和30min通过腹腔注射噬菌体（感染复数＞0.1时），动物的存活率均为100%，在感染后180和360min给予噬菌体治疗，存活率则降至50%和20%，说明早期应用噬菌体的疗效非常明显。另一项研究［25］以产超广谱β－内酰胺酶大肠埃希菌感染小鼠（最小致死量为107CFU·mL－1），感染后20和40min分别进行噬菌体治疗，动物的存活率均为100%。进一步说明噬菌体在由耐药性细菌所引起的动物模型中亦有很好的作用。Watanabe等［26］研究肠源性脓毒血症动物模型时发现：在肠道菌群失调后可由耐氨苄青霉素铜绿假单胞菌引起肠源性脓毒血症，噬菌体经口服后能完全清除肠道内铜绿假单胞菌的繁殖，同时减轻局部和全身炎症反应，并能减少动物的死亡率。Karumidze等［27］从环境中分离出6株克雷伯杆菌噬菌体，体外裂解实验显示：有2株噬菌体（VB－K1p3和VB－K1p4）具有非常宽泛的裂解宿主细胞特性；其从格鲁吉亚和英国的医院共分离出123株肺炎克雷伯菌（包括多重耐药株），来自英国的76%分离株和来自格鲁吉亚的26%分离株对这2株噬菌体非常敏感。噬菌体的生长曲线表明：从噬菌体感染宿主菌到裂解细菌的时间一般为15～20min。

2.4 噬菌体疗法的临床应用 由于噬菌体在动物感染模型中取得了令人满意的结果，因此噬菌体的安全性试验开始在人体上进行。在一项长达12年的试验项目［28］中，将高浓度的葡萄球菌噬菌体应用于人的鼻腔黏膜、口腔、皮下和静脉，最终未发现明显的副反应。在瑞典进行的正式安全性试验结果表明［29］：服用大肠埃希菌噬菌体的志愿者亦未出现安全性问题。最近由美国FDA批准的Ⅰ期临床试验［30］中，噬菌体用于治疗因细菌反复感染（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌）造成的下肢静脉性溃疡，39名患者接受了为期12周的噬菌体治疗，整个试验历时24周，并未显示噬菌体有安全性问题。2009年英国医学和保健品协调署授权皇家耳鼻喉专科医院从事一项噬菌体治疗慢性耳炎的Ⅰ期和Ⅱ期临床研究［31］，慢性耳炎患者的病程均在数年以上，病原菌均为多重耐药的铜绿假单胞菌，噬菌体的商品名称为Biophage－PA，其含有6种针对不同血清型宿主菌的噬菌体，该噬菌体产品由美国Intralytic生物制剂公司提供。该研究采用随机设计的双盲试验，并应用安慰剂进行对照，观察该噬菌体制剂的疗效，结果显示：噬菌体疗法非常有效，而且也是安全的。

3 噬菌体疗法的优势及局限性

噬菌体与抗生素比较有如下优点［32－33］：① 噬菌体特异性强，只针对相应的致病菌，而不会破坏机体的正常菌群。② 噬菌体疗法的副作用少，抗生素则容易引起多种不良反应。③ 噬菌体的指数增殖能力是噬菌体疗法的一个显著优势。在一个裂解周期内，每个噬菌体会产生超过100个子代噬菌体。④ 噬菌体呈宿主依赖性，只在细菌感染的部位发挥作用，随着宿主菌的清除，噬菌体不会残留于体内。⑤ 噬菌体制剂的研制与开发所需时间短、成本低。而新一代抗生素的研制周期一般约为10年。噬菌体治疗亦存在局限性：① 噬菌体在血液和组织中存留，噬菌体作为异源物质，可刺激机体产生免疫反应，产生的抗体可能抑制噬菌体使其失去清除细菌的能力。此外，机体网状内皮系统（reticuloendothelial system）的清除作用也会很快地将噬菌体清除。② 噬菌体的宿主谱窄，噬菌体裂解细菌的作用具有严格的宿主特异性，即某一种或型的噬菌体只能感染并裂解相应种或型的细菌，对其他种或型的细菌不起作用。③噬菌体治疗的剂量和时间有局限性，传统的抗生素应用越早越好，而噬菌体不可以过早使用。根据噬菌体治疗的药代动力学原理解释，只有在细菌达到一定密度的时候噬菌体才开始增殖，噬菌体接种过早或剂量不合适，可能会在其开始增殖之前就被机体清除掉，确定最佳接种时间和剂量将是噬菌体治疗的关键［34］。④ 噬菌体携带一些毒素基因可能会给机体带来不利影响，如大肠埃希菌的不耐热肠毒素基因是噬菌体介导的，因此使用噬菌体前应先纯化，以降低毒素水平。⑤ 宿主菌对噬菌体的抗性，相关研究［33］表明：细菌可通过多种途径抵抗噬菌体的侵袭，如吸附抑制、流产感染和溶原状态的建立等。但随着各种技术和方法的不断改进，上述不利因素可逐渐被克服，如采用多种噬菌体制成的混合制剂（鸡尾酒）来治疗某些常见的细菌感染；或利用分子生物学技术表达噬菌体裂解酶的基因工程产品，用来治疗由多种血清型革兰阳性球菌引起的感染。

面对细菌耐药形势的日益严峻，越来越多的微生物学专家和企业开始将目光转向这种针对细菌的天然病毒，国际一些著名的医药公司开始对噬菌体产生浓厚的兴趣，相信不久的将来会有更多的噬菌体产品走向市场。

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