色素上皮源性因子基因转染对巨噬细胞诱导大鼠增生性玻璃体视网膜病变的抑制作用及其机制

刘 姝，王霁雪，吴雅臻，王淑梅

（吉林大学第二医院眼科，吉林 长春 130041）

增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopath，PVR）常会导致严重的视力损害，但现有治疗手段效果均不理想。随着对PVR病因学的深入了解，基因治疗PVR成为研究的焦点。色素上皮源性因子（pigment epitheliumderived factor，PEDF）是新近发现的一种蛋白质，因其具有多种生物活性，近年来得到了广泛关注。Ogata等[1]发现：PVR患者的PEDF浓度低于孔源性视网膜脱离患者，说明PEDF可能有抑制PVR的功能，其具体机制尚不清楚。另有大量研究[2－4]结果显示PEDF对参与PVR形成的多种细胞及因子均起到了抑制作用：①PEDF对视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cell，RPE）增殖及分化有调节作用。而PEDF的下降可导致RPE细胞退化、变性。这可能主要是通过对细胞周期的阻滞，将RPE细胞阻滞在G0期，阻止其重新进入细胞周期，从而达到抑制细胞增殖的作用。②PEDF对Müller细胞也有影响，PEDF下降会导致Müller细胞的形态、超微结构和功能发生改变[5－6]。③PEDF可以完全抑制由集落刺激因子引起的小胶质细胞的分裂。通过改变了小胶质细胞的形态，使其变为不活动状态，并通过小胶质细胞间接抑制星形胶质细胞的增殖[7]。④PEDF还可以抑制巨噬细胞增殖以及巨噬细胞诱发的炎症反应[8－9]。⑤PEDF亦能增加血管内皮细胞表达FasL[10]，通过FasL诱导黏附在血管壁上的白细胞凋亡，抑制白细胞外渗。⑥PEDF作为血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的拮抗因子[11－12]，可以抑制 VEGF的促生长和移行活性。虽然大量研究间接提示了PEDF可能有抑制PVR的作用，但并无相应的动物实验研究报道。本研究探讨藉由基因转染技术，观察PEDF对PVR形成的影响，初步揭示PEDF在PVR形成过程中发挥的作用，旨在为进一步研究PEDF对PVR形成影响的机制和最终找到临床上治疗PVR的新手段提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器

40只健康雄性SD大鼠，体质量约200g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（吉2007-0003）；pcDNA3-PEDF质粒为本文作者于前期研究[13]中构建，阳离子脂质体Dosper为BoeJuinger Mamdaeim公司产品，抗人PEDF单克隆抗体为R＆D公司产品；隔水式电热恒温培养箱（上海），台式高速离心机（TGL-16G，北京），眼科显微手术器械包（苏州）。

1.2 PVR模型的制备

1.2.1 大鼠腹腔巨噬细胞的提取 将4只SD大鼠剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射10mL无菌液体石蜡，3～4d后收集腹腔细胞。放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入10mL冰中预冷的无菌PBS-H（含10U·mL－1肝素和10%小牛血清的PBS）。轻轻按摩腹部5min。以下均无菌操作。剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。合并渗出液于离心管中，4℃、250g离心10min，弃上清液。用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃、250g离心10min，弃上清液。用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞。

1.2.2 贴壁法纯化大鼠巨噬细胞 用含20%～40%小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成（2～4）×106mL－1。以每平方厘米（2～4）×105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种至培养皿中。于37℃、5%CO2培养箱中培养1h。摇晃培养皿，悬浮未黏附细胞，吸出细胞悬液。用预温的 Hank’s液洗涤细胞3～4次。用含2.5mmol·L－1EDTA的无钙镁 Hank’s液消化细胞37℃、20min。用吸管吹打分离细胞，250g离心10min，弃上清液。用预冷的Hank’s液洗涤细胞3～4次，每次离心250g×10min，弃上清液。最后用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞，将细胞配成8×106mL－1，立即使用。

1.2.3 玻璃体注射活化巨噬细胞诱发PVR模型

SD大鼠按每公斤体质量腹腔注射1%戊巴比妥钠30mg进行麻醉，1%丁卡因眼液滴眼，1%阿托品散瞳。颞上方剪开角巩膜缘处球结膜，距角巩膜缘3～4mm分离成1/2厚巩膜瓣，于剥离的巩膜瓣下方距角巩膜缘后2mm处向玻璃体腔中后部注入巨噬细胞悬液20μL，再于角巩膜缘后2mm处穿刺巩膜长1.5mm，刺入深度为2mm，结膜瓣覆盖，结膜囊内涂抗生素眼膏。

1.3 动物分组及处理

36只清洁级SD大鼠（体质量约200g）随机分为PVR对照组、PVR生理盐水玻璃体腔注射对照组（盐水对照组）和PVR pcDNA3-PEDF玻璃体腔注射组（转染组），每组12只。每组大鼠的右眼为实验眼，左眼作为阴性对照眼。PVR对照组：大鼠右眼玻璃体腔注射巨噬细胞，具体步骤见前述“1.2PVR模型的制备”。盐水对照组：SD大鼠按每公斤体质量腹腔注射1%戊巴比妥钠30mg麻醉，1%丁卡因眼液滴眼。手术显微镜下右眼玻璃体腔内注射生理盐水15μL。于注射生理盐水3d后，右眼玻璃体腔注射巨噬细胞，具体步骤见“1.2.3”。转染组：SD大鼠按每公斤体质量腹腔注射1%戊巴比妥钠30mg麻醉，1%丁卡因眼液滴眼。手术显微镜直视下先剪开大鼠右眼球结膜，于睫状体平坦部垂直刺入微量进样器，并尽量将针头接近对侧视网膜表面，注入15μL脂质体-DNA混合物（将1.5μg质粒DNA溶于7.5μL生理盐水中，再加7.5μL脂质体混匀，静置30min）。于玻璃体腔内转染pcDNA3-PEDF 3d后，右眼玻璃体腔注射巨噬细胞，具体步骤见 “1.2.3”。

1.4 检测指标

分别于玻璃体腔内注射生理盐水或质粒pcDNA3-PEDF后3d，采用检眼镜和全视网膜镜观察大鼠玻璃体及视网膜情况；于玻璃体腔注射巨噬细胞后3d和1、2、3、4周行检眼镜检查并采用全视网膜镜观察PVR形成情况。分别于注射巨噬细胞后1、2、3和4周摘除SD大鼠眼球，固定包埋，4μm切片，HE染色，光镜观察标本的玻璃体、视网膜各层结构和细胞增殖情况。

2 结 果

2.1 各组大鼠PVR 形成情况

玻璃体腔内注射生理盐水或质粒pcDNA3-PEDF后3d，盐水对照组和转染组大鼠均可见玻璃体无明显混浊，眼底清晰，视网膜平伏；玻璃体腔注射巨噬细胞后3d，可见3组大鼠玻璃体腔内均有明显的雾状混浊，眼底隐约可见视网膜平伏。注射后1周见3组大鼠玻璃体腔内均有轻度的雾状混浊，眼底可见视网膜平伏。PVR对照组和盐水对照组大鼠可见玻璃体腔内条索状增殖膜。注射后2周3组大鼠玻璃体雾状混浊基本消失，PVR对照组和盐水对照组大鼠可见明显增殖改变，2组大鼠中各有1鼠（1眼）出现网膜牵拉隆起；转染组大鼠玻璃体无明显混浊，眼底清晰，视网膜平伏。注射后3周PVR对照组和盐水对照组大鼠玻璃体腔有明显增殖改变，有条索状增殖物牵引网膜，其中PVR对照组1鼠（1眼），盐水对照组2鼠（2眼）出现牵拉网脱；转染组大鼠中1鼠（1眼）可见玻璃体腔内牵拉条索，余实验眼玻璃体腔和视网膜未见明显异常。注射后4周见PVR对照组和盐水对照组大鼠均出现牵拉网脱，玻璃体腔内增殖明显；转染组大鼠可见1鼠（1眼）出现玻璃体牵拉，视网膜浅脱离，余实验眼玻璃体无明显混浊，眼底清晰，视网膜平伏。大鼠阴性对照眼玻璃体和眼底正常。见图1（插页三）。

2.2 各组大鼠视网膜和玻璃体形态学

转染组大鼠视网膜各时间段均表现为各层细胞结构清晰，仅1眼发生视网膜浅脱离，可见视网膜前增殖膜，伴少量炎性细胞浸润。PVR对照组和盐水对照组大鼠可见随病程进展的炎症反应，玻璃体腔注射巨噬细胞1周后可见炎症反应最严重，玻璃体内炎症细胞聚集，并出现成纤维细胞；注射2周后见玻璃体内炎症细胞浸润，成纤维细胞增殖，形成胶原纤维，脱离的视网膜组织结构不清；注射3周后见成纤维细胞大量增殖，胶原增加形成瘢痕，视网膜大部分脱离，视网膜各层组织被纤维结缔组织代替；注射4周后见眼球萎缩，玻璃体腔内成纤维细胞过度增殖纤维化，视网膜脱离、聚集、结构不清。见图2（插页三）。

3 讨 论

PVR是在孔源性视网膜脱离或视网膜复位手术后和眼穿通伤后，由于玻璃体内及视网膜表面的细胞增生和收缩，造成牵引性视网膜脱离。过去的十多年内，经玻璃体手术治疗PVR已日趋成熟，成功率显著提高，但术后仍有一些患者PVR复发，其原因主要与前部增生性玻璃体视网膜病变有关。对于玻璃体切除术后复发PVR者，再手术的成功率较低，且易导致最终视力丧失。鉴于以往报道中PEDF对参与PVR形成的多种细胞和因子的综合抑制作用，本实验选择应用PEDF进行基因治疗。以往应用PEDF进行基因治疗通常使用病毒载体，而本研究选择脂质体介导质粒DNA，与重组病毒比较具有操作简便、可以容纳更大的插入序列、容易产生、整合和扩散危险小等特点[14]，因此可以在动物模型细胞增生活跃的时间内达到治疗作用，避免重复注射。本研究在转染组大鼠玻璃体腔内注射巨噬细胞诱导PVR形成前3d即进行了重组hPEDF基因的转染，而未采用同期注射，是考虑到鼠眼玻璃体腔内容积有限，大量液体注入会造成眼内压急剧增高，导致眼组织的损伤，同时也降低了转染的效率。尽管大量研究表明脂质体介导玻璃体腔注射转染的基因可在24h内即出现明显表达，本研究选择了提前3d进行转染，结果显示分期注射未对大鼠眼组织造成明显损伤，转染的PEDF可在PVR动物模型细胞增生期内持续表达，因而通过此种方法可以达到有效的预防作用。对于脂质体介导转染的安全性，已有研究者[15]通过电镜观察证实：Dosper可转导质粒外源基因至活体鼠眼组织，且不会导致眼球结构的改变和眼内炎症。本实验也观察到Dosper介导重组hPEDF基因玻璃体腔注射转染对眼组织无明显毒性作用，同时PEDF因其自身的神经营养功能，本身亦可起到对视网膜的保护作用[16]。

本研究初步证实了PEDF对巨噬细胞诱导的PVR形成有抑制作用。PEDF作为一种内源性蛋白，组织相容性较好，对视网膜无明显毒性，通过玻璃体腔注射转染可以在眼组织局部发挥作用。因此，应用PEDF基因转染作为抑制PVR的一种新的方法，为临床治疗PVR开辟了新的思路。

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