NDGA对移植入损伤脊髓后的化学去细胞肌肉支架中的羊膜上皮细胞存活的影响

张秀英，薛 辉，李 忱，刘佳梅，李 岩，陈 东

（1.吉林大学护理学院基础护理教研室，吉林 长春 130021；2.吉林大学白求恩医学院组织学与胚胎学系，吉林 长春 130021；3.吉林大学中日联谊医院骨科，吉林 长春130033；4.吉林省妇幼保健院眼科，吉林 长春130061；5.广东医学院组织学与胚胎学教研室，广东 东莞 523808）

目前，“种子细胞＋生物分子＋生物支架”被认为是治疗脊髓损伤的基本模式[1]。用于移植治疗脊髓损伤的种子细胞有多种，其中羊膜上皮细胞（amniotic epithelial cells，AECs）由于具有来源广泛、免疫原性低、不涉及伦理问题、能分泌各种神经营养因子和具有多项分化能力等特点，越来越受到科学工作者的关注[2－3]。本课题组应用化学去细胞肌肉支架和AECs共同治疗脊髓半横断损伤发现：AECs主要是通过分泌神经营养因子促进了脊髓损伤大鼠运动功能的恢复[4]。但由于脊髓损伤后炎症反应的攻击，移植细胞的数量通常在移植后会急剧减少[5]，因此，提高移植AECs的存活率将更有利于其在脊髓损伤中的治疗作用。NDGA是选择性的5-脂肪氧化酶的抑制剂，可抑制花生四烯酸代谢，降低白细胞三烯和前列腺素的合成，从而减少炎症反应。研究[6]显示：NDGA可抑制巨噬细胞活性和趋化反应，有效避免炎症反应对移植体内胰岛细胞的攻击，延长移植细胞的寿命[7]。因此，NDGA有可能延长移植入化学去细胞肌肉支架中AECs的存活时间，增加移植细胞的存活数量，促进其在脊髓损伤中的治疗作用。但目前尚无NDGA治疗脊髓损伤的相关报道。本研究拟将不同水平的NDGA应用于脊髓损伤，观察NDGA对化学去细胞肌肉支架中的AECs存活的作用，以及对损伤脊髓血管再生和内源性神经干细胞的影响，为其在脊髓损伤中的应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 72只体质量230～280g雄性Wistar大鼠和6只孕12～14d孕鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（吉2007-0003）；含10%胎牛血清的DMEM培养液（Hyclone公司），多聚甲醛（北京化学试剂公司），Dil（Invitrogen生物公司），NDGA（美国Sigma公司），青霉素（华北制药股份有限公司），蔗糖（北京化工厂），OCT包埋剂（长春博大生物公司），10%羊血清（北京鼎国生物公司），VEGF一抗（Santa Cruz生物公司），FITC二抗（美国Jackson Immunoresearch Labs），BSA（北京鼎国生物公司），一抗 NG2（美国millipore公司），DAB（迈新生物公司）恒冷箱切片机（德国Leica公司）；荧光显微镜（日本Nikon公司）；培养箱（美国Nopco公司）。

1.2 大鼠AECs的分离和培养 取妊娠中期（12～14d）Wistar大鼠6只，以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，在无菌条件下剥离大鼠胚胎羊膜，用0.25%的胰酶消化并收集大鼠AECs，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液中，细胞数以1×109L－1的密度接种至培养瓶中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中静置培养。移植前采用Dil标记。

1.3 化学去细胞肌肉支架的制备 将3只 Wistar大鼠脱颈处死，行背正中切口，顺椎旁肌纤维方向切取2cm×1cm×2cm大小的条形椎旁肌。将肌肉放于蒸馏水中，在摇床中以37℃、50r·min－1摇48h；之后再转入3%Triton X-100溶液，于摇床中37℃、50r·min－1摇48h；再转入蒸馏水中，以37℃、50r·min－1摇床中摇48h；然后放入1%SDS溶液，于摇床中37℃、50r·min－1摇48h；再放入PBS中于摇床中清洗24h，中间换液。最后按肌纤维方向修剪整齐后放入PBS中4℃保存备用。

1.4 动物分组及给药 将72只成年雄性大鼠随机分成生理盐水组和20、30、40mg·kg－1DNGA组，每组18只。每组分别于术后1、2和4周随机选取6只大鼠进行取材。生理盐水组：去细胞肌肉支架联合AECs移植治疗大鼠脊髓半切损伤，腹腔注射生理盐水；20mg·kg－1NDGA组：去细胞肌肉支架联合AECs移植治疗大鼠脊髓半切损伤，腹腔注射20mg·kg－1NDGA；30mg·kg－1DNGA组：去细胞肌肉支架联合AECs移植治疗大鼠脊髓半切损伤，30mg·kg－1NDGA腹腔注射；40mg·kg－1NDGA组：去细胞肌肉支架联合AECs移植治疗大鼠脊髓半切损伤，40mg·kg－1NDGA腹腔注射。

1.5 大鼠脊髓半横断损伤模型制备与化学去细胞肌肉支架联合AECs的移植治疗 取生长良好的大鼠AECs，待70%融合时，用 Hank’s液冲洗2次，加入体积分数为0.5mL·L－1Dil的Hank’s液，置于4℃、15min，再移入37℃培养箱中5min，Hank’s液冲洗后室温下以0.125%胰蛋白酶消化。离心去除胰酶，用DMEM培养液重悬并调节细胞密度为2×106mL－1。将AECs移入EP管中放入37℃培养箱中待用。取成年雄性Wistar大鼠3只，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露T9－T10段脊髓，用虹膜剪剪下右半侧约2mm长的一段脊髓。将支架修剪至合适大小，用1mL注射器吸入AECs悬液，注入0.2mL细胞悬液于去细胞肌肉支架中。于缺口处植入移植物，在移植物上方用保鲜膜覆盖以固定移植物，然后逐层封闭伤口。术后各组大鼠分别给予生理盐水和20、30、40mg·kg－1NDGA腹腔注射1周，并且各组大鼠应用青霉素腹腔注射常规抗感染1周。

1.6 各组大鼠支架中的AECs数量的检测 各组大鼠分别于术后1、2和4周各取6只，采用10%水合氯醛行腹腔麻醉，生理盐水、4%多聚甲醛灌流固定、暴露脊髓T8～T12、迅速取出脊髓组织、于4%多聚甲醛后固定4h、蔗糖梯度脱水、OCT包埋、－70℃保存。用恒冷箱切片机行冠状切片，厚16μm，甘油封片。荧光显微镜下观察支架中AECs数量，并根据 Taylor[2]和 Pan[8]的方法进行计数，具体如下：每只动物选5张切片（间距80μm），每张切片随机选6个高倍镜视野进行计数，之后用5张切片的平均值作为该动物的阳性细胞数，计数各时间点每组6只动物的平均值。

1.7 免疫荧光组织化学法观察各组大鼠血管再生情况 取各组大鼠术后1周的切片，每隔7张取1张，经10%羊血清封闭30min，VEGF一抗（1∶100稀释）4℃孵育过夜，PBS冲洗，二抗（FITC标记羊抗小鼠，1∶400稀释）室温孵育1h，PBS冲洗，甘油封片。在荧光显微镜下观察并计数：计数移植区周围但不包括移植区的血管面积百分比。每只动物选5张切片（间距80μm），每张切片随机选6个高倍镜视野照片，采用图像处理软件IPP6计算其血管阳性面积百分比，之后用5张切片的平均值作为该动物的阳性面积百分比，计数每组6只大鼠的血管阳性面积百分比的平均值。

1.8 免疫组织化学法观察各组大鼠内源性神经干细胞的数量 各组大鼠于术后1周灌流、固定、包埋和切片，每隔7张取1张切片，依次经PBS冲洗、0.01%Triton X-100打孔，PBS 冲洗，0.3%H2O2灭活，5%BSA封闭30min，羊血清封闭30min，加入一抗NG2（1∶100稀释）4℃孵育过夜，PBS冲洗，加入二抗、HRP标记的三抗，室温孵育10min，PBS冲洗，DAB显色。普通光学显微镜观察NG2阳性内源性神经干细胞并计数，计数移植区周围NG2阳性细胞。每只大鼠选5张切片（间距80μm），每张切片随机选6个高倍镜视野计数其NG2阳性细胞数，之后用5张切片的平均值作为该动物的NG2阳性细胞数，计数每组6只大鼠NG2阳性细胞数的平均值。

1.9 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。AECs阳性细胞计数、血管阳性面积百分比和NG2阳性细胞计数以±s表示，组间比较采用One-way ANOVA。

2 结 果

2.1 各组大鼠移植物中AECs数量 移植后1、2和4周，各组大鼠AECs分别为：生理盐水组，74.17±12.64、57.17±19.68和31.83±10.50；20mg·kg－1NDGA组，107.50±48.64、85.33±32.38和41.67±13. 53；30mg·kg－1NDGA组，291.67±31.66、233±30.44和134.50±32.69；40mg·kg－1NDGA 组，280.50±49.45、230±54.85和120.33±33.97。随着时间的延长，各组大鼠AECs的数量均逐渐减少，到第8周时，4组大鼠AECs均完全消失。同一时间点，与生理盐水组比较，20mg·kg－1NDGA组大鼠存活的AECs数无明显差别，而30和40mg·kg－1NDGA组大鼠存活的AECs数量明显高于生理盐水组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1（插页二）。

2.2 术后1周各组大鼠支架周围脊髓血管 各组大鼠术后1周的VEGF免疫荧光染色检测，与生理盐水组（4.79%±0.40%）比较，随着NDGA浓度的逐渐增加，各组大鼠血管阳性面积百分比逐渐下降，20mg·kg－1NDGA组大鼠血管阳性面积百分比（4.08%±0.72%）最大，30mg·kg－1NDGA 组 大 鼠（2.98% ± 0.35%） 次 之，40mg·kg－1NDGA组大鼠血管阳性面积百分比（2.22%±0.26%）最小，20mg·kg－1NDGA组与生理盐水组间血管阳性面积百分比的差异无统计学意义外，其他各组间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2（插页二）。

2.3 术后1周各组大鼠支架周围脊髓组织内源性神经干细胞 术后1周的NG2免疫组织化学染色检 测 结 果：生 理 盐 水 组（70.00±10.04）、20mg·kg－1组（64.17±14.65）、30mg·kg－1组（63.83±12.78）和 40mg·kg－1组（55.17±11.87）之间大鼠NG2阳性细胞数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3（插页二）。

3 讨 论

本研究发现：NDGA可以增加移植入脊髓损伤处化学去细胞肌肉支架内AECs的存活数量，对脊髓损伤后的NG2阳性内源性神经干细胞无影响，但随应用剂量的增加可抑制新生血管的形成。这些证据提示应用NDGA能够促进脊髓损伤处移植细胞的存活，对改善细胞移植治疗脊髓损伤的效果具有重要意义。

NDGA的应用有利于AECs的存活，为治疗脊髓损伤促进移植细胞的存活提供了有效的手段。脊髓损伤早期的炎症反应是导致移植细胞死亡的主要原因。脊髓损伤后的炎症反应在损伤后1周内反应最强，之后逐渐减弱[9]。所以，为避免炎症反应对细胞存活和分化的影响，Okano等[10]建议将细胞移植的时间放在损伤后1周。但脊髓损伤后及时的治疗对于运动功能恢复具有重要意义。比如红核神经元逆向运输在脊髓损伤3d后就消失[11]，因此如果细胞移植的时间选择在脊髓损伤后1周，那么移植细胞分泌的神经营养因子就不能有效地促进红核脊髓束的再生。可见抑制脊髓损伤后早期的炎症反应对于细胞移植促进损伤脊髓的功能恢复具有重要的意义。有研究[12]证实：参与脊髓损伤早期炎症反应的主要细胞为巨噬细胞、中性粒细胞、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）和 白 细 胞 介 素 1β（interleukin-1beta，IL-1β）等炎症因子。本课题组研究[6]表明：NDGA能够抑制脊髓损伤早期巨噬细胞和中性粒细胞的浸润以及炎症因子的表达，从而减轻脊髓损伤早期的炎症反应。所以，NDGA可能促进移植到脊髓损伤大鼠体内AECs的存活。本研究结果显示：30和40mg·kg－1NDGA 明显地促进了大鼠AECs的存活，与20mg·kg－1NDGA组及生理盐水组比较差异有统计学意义，这说明NDGA只有达到一定量后才对移植细胞的存活具有促进作用。同时也说明NDGA本身对移植细胞无毒性作用。所以，在脊髓损伤的治疗中，应用NDGA促进移植细胞的存活是一种安全有效的方法。

NDGA对损伤脊髓内源性神经干细胞无影响，使其应用于脊髓损伤的治疗成为了可能。脊髓损伤后，有髓神经纤维的再生对于损伤脊髓运动功能的恢复具有重要意义。参与髓鞘再生修复的主要细胞来源是Olig2阳性的少突胶质细胞的前体细胞，而这些细胞来自于表达NG2阳性内源性脊髓神经干细胞的分裂增生[13]。所以，NG2阳性内源性神经干细胞或少突胶质细胞前体细胞的增生、存活和分化受阻均会导致脊髓损伤后髓鞘再生障碍。然而NDGA的生物学作用不仅能够抑制炎症反应，而且还具有抑制肿瘤生长的作用，所以NDGA可能抑制NG2阳性内源性神经干细胞的增生、存活和分化。故本研究观察了NDGA对NG2阳性内源性神经干细胞的增殖的影响，以确定NDGA治疗脊髓损伤的潜在副作用。本研究结果证实：与生理盐水组比较，不同浓度NDGA组大鼠NG2阳性内源性神经干细胞的数量差别不明显。说明NDGA对NG2阳性内源性神经干细胞的增生、存活和分化无影响。所以，NDGA在脊髓损伤的治疗中具有良好的应用前景。

NDGA对血管再生有抑制作用，故选择NDGA治疗脊髓损伤的合适剂量是关键。脊髓损伤后，组织工程支架作为桥接脊髓的2个断端和移植细胞的载体是必不可少的。然而血运重建是损伤脊髓神经纤维再生和功能恢复的基础。本课题组前期工作[14]已经证实：化学去细胞肌肉支架移植到损伤脊髓中能够被良好的血管化，使迁入的细胞获得足够的营养，修复损伤组织。然而有研究将不同浓度的NDGA加入鸡胚神经节中观察鸡胚神经节的血管生成情况时发现：NDGA对血管生成有明显的抑制作用，并且随着浓度的增加抑制作用更明显[15]。因此，本研究也观察了不同浓度NDGA对脊髓损伤后血管生成情况的影响，以便筛选出NDGA应用的最佳用量。本研究结果证实：支架周围脊髓组织内的新生血管受NDGA的影响，且随着NDGA浓度的增加新生血管阳性面积百分比逐渐下降。但是，根据本研究中AECs和NG2阳性内源性神经干细胞的存活情况判断，NDGA的短时应用（损伤后1周）造成的血管阳性面积的减少并不会影响细胞的存活。NDGA可以成为辅助生物支架和细胞移植联合治疗脊髓损伤的理想的生物分子。

综上所述，NDGA有可能成为改善移植细胞存活从而辅助治疗脊髓损伤的有效药物。

[1]Xu XM， Guenard V， Kleitman N， et al. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord [J].J Comp Neurol，1995，351（1）：145-160.

[2]Taylor SJ，Rosenzweig ES，McDonald JW，et al.Delivery of neurotrophin-3from fibrin enhances neuronal fiber sprouting after spinal cord injury [J].J Control Release，2006，113（3）：226-235.

[3]Niknejad H， Peirovi1 H， Ahmadiani A， et al.Differentiation factors that influence neuronal markers expression in vitro from human amniotic epithelial cells [J].European Cells Mater，2010，19（1）：22-29.

[4]Xue H，Zhang XY，Liu JM，et al.Development of a chemically extracted acellular muscle scaffold seeded with amniotic epithelial cells to promote spinal cord repair [J].J Biomed Mater Res，2013，101（1）：145-156.

[5]Copland IB，Galipeau J.Death and inflammation following somatic cell transplantation [J].Semin Immunopathol，2011，33（6）：535-550.

[6]Xue H，Zhang XY，Liu JM，et al.NDGA reduces secondary damage after spinal cord injury in rats via anti-inflammatory effects[J].Brain Res，2013，21（4）：83-92.

[7]Yang TY，Chen JP，Ku KW，et al.Survival prolongation of microencapsulated allogeneic islet by nanosized nordihydroguaiaretic acid [J]. Transplant Proc，2005，37（4）：1828-1829.

[8]Pan HC，Cheng FC，Lai SZ，et al.Enhanced regeneration in spinal cord injury by concomitant treatment with granulocyte colony-stimulating factor and neuronal stem cells [J].J Clin Neurosci，2008，15（6）：656-664.

[9]Beck KD，Nguyen HX，Galvan MD，et al.Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury：evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment [J]. Brain，2010，133（2）：433-447.

[10]Okano H，Ogawa Y，Nakamura M，et al.Transplantation of neural stem cells into the spinal cord after injury [J].Semin Cell Dev Biol，2003，14（3）：191-198.

[11]Houle JD，Tessler A. Repair of chronic spinal cord injury [J].Exp Neurol，2003，182（2）：247-260.

[12]Hall CE，Priestley JV，Perry VH，et al.Docosahexaenoic acid，but not eicosapentaenoic acid，reduces the early inflammatory response following compression spinal cord injury in the rat [J].J Neurochem，2012，121（5）：738-750.

[13]Lytle JM，Wrathall JR.Glial cell loss，proliferation and replacement in the contused murine spinal cord [J].Eur J Neurosci，2007，25（6）：1711-1724.

[14]Zhang XY，Xue H，Liu JM，et al.Chemically extracted acellular muscle：A new potential scaffold for spinal cord injury repair [J].J Biomed Mater Res，2012，100（3）：578-587.

[15]孙慧勤，陈意生.去甲二氢愈创木酸对活体血管生成作用的实验研究 [J].第三军医大学学报，2001，23（3）：276-279.