神经组织工程修复脊髓损伤的研究进展（天然生物支架修复脊髓损伤）

马犇，彭宝淦

（1.徐州医学院，江苏 徐州 221004；2.武警总医院，北京 100039）

脊髓损伤（Spinal Cord Injury SCI）是一种以脊髓损伤平面以下感觉运动功能丧失、大小便失禁、性功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统疾病，临床上以创伤引起的脊髓损伤常见。脊髓损伤的康复是当今仍未解决的医学难题，究其原因是人类中枢神经只具有极其微弱的再生能力，多种病理生理活动及多种代谢产物参与导致损伤部位的微环境变化，不利于神经轴突的再生长造成。

近年采用细胞移植、组织工程、转基因技术等治疗方法修复脊髓损伤，取得了一定进展。这些研究在促进损伤神经再生能力及改变脊髓损伤部位的微环境做了尝试，其中神经组织工程技术的发展，在修复脊髓损伤，促进功能康复取得了较大的进步。神经组织工程是以支架为载体载入种子细胞进入损伤部位或植入新的组织，以达到修复损伤的神经组织的目的。种子细胞目前报道有神经干细胞、嗅鞘细胞、许旺细胞、胚胎干细胞、骨髓基质干细胞等[1-3]。支架是神经组织工程里不可或缺主体，其主要作用能桥接损伤的脊髓，为脊髓中神经轴突生长桥接提供空间和营养，还能作为种子细胞移植治疗神经损伤的土壤，引导细胞的生长、增殖、分化、迁移以及凋亡，从而促进脊髓神经的再生。完美的支架应该具备良好的生物相容性及支架降解产物无毒性，良好的机械支撑力，适合轴突生长的孔隙率及三维立体的空隙结构，良好的可塑性及粘附力[4]。作为细胞移植的载体，按构成支架的材料的属性可以将支架分为天然生物支架（天然生物材料是在自然条件下生成的生物材料，主要包括天然纤维、生物体组织、结构蛋白和生物矿物等材料[3]），人工材料合成支架（相对于“天然材料”而言。自然界以化合物形式存在的、不能直接使用的，或者自然界不存在的，需要经过人为加工或合成后才能使用的材料[1-4]），及复合型支架（基于天然材料和人工材料混合而成的支架）3大类。天然生物支架因具有与宿主的良好的生物相容性、降解产物无毒性及良好的粘附力成为研究的热点，去细胞组织支架作为天然生物支架重要分支，在细胞信号识别，促进细胞的粘附、增殖和分化等方面有独特优势，现就天然生物支架修复脊髓损伤的应用进行综述。

1 天然生物材料合成支架在脊髓损伤修复中的研究

天然生物材料，主要包括天然纤维、生物体组织、结构蛋白和生物矿物等材料[3]。天然生物支架包括基于天然材料合成的支架、天然的组织及天然组织的衍生支架。天然生物材料合成支架常是运用天然生物材料合成的天然可降解的管状，或者打印成条状通道结构的高孔隙率的支架。天然材料有透明质酸、胶原、纤维蛋白、藻酸盐、壳聚糖、聚羟基丁酸酯及甲基纤维素水凝胶等，他们既可以单独作为支架，也可以作为天然材料合成支架。因而这些天然材料及其合成的天然生物支架具有良好的生物相容性、细胞亲和性和可降解性，且降解产物无毒性，能较好地促进细胞黏附、增殖[3，4]。

透明质酸广泛存在与细胞外组织间隙中，可以很大程度减少损伤部位的淋巴细胞迁移及分化，阻止其炎症趋向性，能阻止炎症细胞的吞噬作用而达到减轻脊髓损伤的二次损伤，促进创伤后的脊髓神经组织再生[5，6]。然而透明质酸制成的支架对种子细胞的粘附能力较弱，这在近期的研究中的到改善，有学者将层粘连蛋白Laminin（LA）加入透明质酸制成支架，或者在支架上涂上赖氨酸涂层[7]，使其粘连能力得到很大改善。然而由于透明质酸支架的支撑强度较弱，以及其很高的降解率没有得到改善，现已较少运用到脊髓损伤的修复。

胶原（collagen）是人体和脊椎动物的主要结构蛋白，作为重要的细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）成分，具有细胞黏附信号的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基因序列，从而促进种子细胞在支架上得黏附、促进种子细胞的分化及迁移，机体的轴突有利于附着在胶原支架上从而有利于轴突的再生[8]。在脊髓损伤部位胶原还可携带生长因子参与调节局部微环境和减少瘢痕组织形成，有利于损伤的恢复[9]。但这些再生的神经纤维是杂乱无章的，胶原制成的支架不能引导再生的纤维通过损伤部位而达到尾端组织而形成完整的神经通路[10]，也有文献报道在损伤部位过高胶原浓度，会阻碍神经轴突的生长[11]。

其他用于制成支架修复脊髓损伤的天然材料还包括藻酸盐、壳聚糖及水凝胶等，还有一些基于蛋白：如纤维素蛋白的合成支架也被尝试用于修复脊髓损伤[12，13]。这些研究显示基于天然材料合成的支架相比于人工材料合成的支架有提高种子细胞的粘附能力，良好地生物相容性及降解无毒性，延长种子细胞的体内存活时间，提高种子细胞向神经细胞的分化率，较好的促进组织再生及功能康复等优势[1]。有些学者发现原始材料直接用于修复时机械支撑力弱，不能引导再生的神经组织有效通过损伤区，降解速率与机体康复不同步等缺陷[1，13]，如果以天然材料重新塑形，合成支架也会面临支架硬度，降解度不匹配组织修复的进度，且孔隙率很难完全匹配神经轴突的再生长。面对这些问题，天然材料合成的支架要修复脊髓损伤还需要很多改进。

2 去细胞组织支架修复脊髓损伤的优势

综上所述，基于天然材料合成支架存在不同程度的缺陷，不能很好解决脊髓损伤的修复问题。近年来去细胞组织支架成为人们研究的热点，去细胞支架是生物组织经人工萃取及去细胞等处理而来的的天然组织支架，被广泛的用于天然生物材料合成支架的替代而用于组织修复研究中[1-4]。去细胞组织支架因具备天然组织及天然生物原料及其合成支架的优点，同时也具备高仿真三维立体结构，对损伤部位的机械支撑力适中，降解率匹配组织再生修复速率等优势，现已成为近期研究的热点。将组织中的细胞蛋白质等物质用化学方法去除，得到无抗原的天然的去细胞组织支架，这些支架具备生物相容性好，免疫原性低，且制作方便，移植到体内能为种子细胞提供尽可能接近体内环境的生长空间[1-4]。去细胞组织技术在皮肤病、泌尿系统损伤，消化疾病，心血管疾病、呼吸系统疾病，肌肉等组织修复方面已有广泛应用[1-4，14-16]。

Sondell等17于1998年率先报道了用大鼠的去细胞坐骨神经支架修复坐骨神经损伤，取得了不错的效果。新鲜的坐骨神经被取下后，采用Triton X-100和脱氧胆酸钠化学萃取的方式去除掉坐骨神经组织中的细胞等成分，剩下纤维骨架及基膜组织，电镜扫描下可以看到神经细胞被萃取，剩下疏松的多孔的三维立体结构支架。将此支架移植入体内，20天后，相比于移植未萃取的组织对照组，萃取组可观察到大量的微血管及神经轴突通过损伤区，运动功能得到明显改善。Hudson和Rovak等在随后的啮齿动物模型上使用的大量的去细胞神经异体组织移植的实验中证明其移植后几乎不引起免疫排斥反应[18，19]。Hu 等[20]采用去细胞处理同种异体神经复合骨髓基质干细胞修复灵长类动物长节段尺神经缺损，术后6个月，修复效果与自体移植相似。

在中枢神经系统损伤中，常常因为中枢损伤得不到有效的修复而造成永久的功能丧失。人工材料合成的支架由于降解物的毒副作用而让研究者望而却步，基于天然材料合成的支架也或多或少存在缺陷。Ribatti等[21]将SD大鼠脑组织去细胞处理后植入鸡胚绒毛膜尿囊膜结果显示能明显促进血管新生，并且没有发现炎细胞浸润。脊髓细胞构成和大脑相似，由此，此研究为去细胞组织支架修复中枢神经系统损伤提供了理论支持。

Guo等[22]率先报道了去细胞脊髓组织支架的研究工作，采取Sondell萃取组织细胞方法并加以改进，将脊髓组织冻融，再采用改良的化学萃取法制作去细胞脊髓组织支架。支架外观结构和正常脊髓形状相似，呈半透明绒毛状，组织支架内神经轴突及辅助细胞成功萃取掉，剩下高孔隙率的三维立体的疏松孔道状结构的支架，经其测量空隙直径为6-150 um，孔隙率高达90%以上，其平面结构由不同大小的空隙纵向平行或不规则排列成孔道样，并相互惯通，具有高度的仿真性，此结构能为神经轴突的再生提供天然的引导，再生的神经从而可以有效的通过损伤区，达到尾端，为再生的神经与尾端神经组织的耦合提供了条件。该研究还提示去细胞脊髓组织支架具有良好的生物相容性，免疫原性极弱。通过同种异体组织支架移植的对比研究发现，移植支架组未见免疫排斥反应。该文章分析，免疫排斥反应物质主要来源于主要组织相容性抗原复合物（Major Histocompatibility Complex，MHC），其主要存在于细胞膜表面及神经轴突的髓鞘成分，去细胞脊髓组织支架经过萃取的过程，组织内无细胞髓鞘等残留。Liu等[23]做了更进一步的研究，其采用去细胞脊髓组织支架复合人脐血干细胞修复SD大鼠脊髓损伤，取得了不错的效果。在该研究中，马松三色染色结果显示支架由主要成分为胶原。去细胞脊髓组织支架表现出较好的粘附力，细胞支架在体外联合培养时，细胞可均匀分布在支架内。移植入体内后，三维立体结构使部分种子细胞可以在组织及正常组织内自由的迁移，种子细胞可分化为星形胶质细胞及少突胶质细胞，并释放促轴突再生的生长因子，促进轴突的再生，引导再生的轴突通过损伤区，与尾端组织相连。支架复合细胞移植入体内还使邻近损伤部位的受损神经轴突的凋亡及轴突的髓鞘空泡化变减轻。该研究提示去细胞脊髓组织支架复合干细胞不仅可以促进神经轴突的再生，还能保护邻近损伤的神经，达到了修复脊髓损伤，促进功能的恢复。

近来，Zhang等[24]还尝试采用肌肉组织去细胞支架来修复脊髓损伤，并取得一定的进展。分析去细胞肌肉支架，构成支架的胶原纤维的三维空间结构与去细胞脊髓支架相似，该研究还显示了去细胞肌肉组织支架的理化性质和去细胞脊髓支架类同，都具有良好地生物相容性及低免疫原性，较高的孔隙率及三维立体网状结构，生物降解率和脊髓修复时间相匹配等优点。移植后8周可明显观察到大量的轴突长入支架内，并在支架的引导下通过损伤区，并获得良好地功能恢复。相比于去细胞脊髓组织支架，去细胞组织支架还具有取材方便，可自体移植等优点。

综上所述，组织工程技术在移植材料、支架制备技术等方面的迅速发展已经为脊髓损伤后神经功能的修复展现了广阔的前景，但仍然有些问题未得到解决。人工材料合成的生物组织支架因其本身不可改变的属性往往使其和细胞亲和粘附性不佳、降解速率不确定及降解产物有毒、孔隙率及三维立体结构很难把握而限制了其运用，大有被天然生物材料取代的趋势。天然的生物支架材料有较低的免疫原性，对细胞有较好的粘附力，还能包被目的生长因子在支架内，从而促进种子细胞的存活时间，并促进种子细胞的分化等优势，但天然生物材料的机械强度不高，降解率不能匹配组织再生修复的速率，而基于天然材料合成的支架又受限于制作工艺不高，较难按设想加工塑形的局限，很难达到理想支架的状态，故还需要更多的研究来改进。与之相较，将去细胞组织支架尤其是去细胞脊髓组织支架作为脊髓损伤修复的组织工程支架具有许多独特优势：支架来源于天然组织，因此具备天然材料支架的属性；其孔隙率及天然的三维立体网状结构有利于种子细胞的存活及分化，并有利于轴突的再生长，并引导轴突通过损伤区；其机械强度及生物支撑度和脊髓相似，能满足损伤区的支撑需求。因此，去细胞组织支架是现阶段修复脊髓损伤的最好选择。神经去细胞组织工程技术的发展复合日渐成熟的药物缓释技术，将推动中枢神经损伤的修复再上新台阶。

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