NF-κB在TNF诱导凋亡中的作用

王京 沈定霞

众所周知，TNF可诱导肿瘤细胞发生凋亡。在这一过程中，NF-κB会被激活，同时还可抑制肿瘤细胞发生的凋亡[1-3]。细胞可以通过NF-κB这一通路产生抗凋亡效用和起到转导信号的作用。NF-κB的研究日渐增多，其中在TNF诱导肿瘤细胞发生凋亡的过程中的作用逐渐被重视。

1 NF-κB的定义

核转录因子（nuclear transcription factor）是一种能与启动子区的固定核酸序列结合从而激活基因的转录功能的特殊蛋白质。有一种核蛋白因子，能特异结合免疫球蛋白κ链基因上GGGACTTTCC这一增强子序列，然后促进细胞表达κ轻链，这种蛋白质最早发现于B细胞的核提取物中，所以被称做NF-κB。目前，将其归为NF-κB/ReL蛋白家族成员，此家族成员目前包括以下几类：（1）p50及其前体p105 （NF-κB1）；（2）p52及其前体p100 （NF-κB2）；（3）C-Rel；（4）P65 （RelA）和（5）RelB。此家族成员均包含一个氨基末端，包括DNA结合部位、二聚体化部位以及和IκB 结合的位点 -NLS（nuclear translocation signal），主要负责形成二聚体，与DNA以及抑制蛋白IκB结合，此氨基末端来源非常保守，由300个左右氨基酸组成，称为Rel同源 区（rel homology domain，RHD） 或 NRD（NF-κB/ReL/dorsal）， RHD含有的NLS定位序列可以促使活化的NF-κB进入细胞核而实现本身的功能。NF-κB二聚体与DNA结合后，可形成一个有活性的结构。NF-κB/ReL蛋白大家族各成员之间可以形成同源的或异源二聚体，而这些蛋白二聚体不同的组成结构的结合序列也不相同，而且各自具有各自的特性，DNA靶目标的细微不同都可以被NF-κB二聚体的不同形式识别出来，从而使得面对不同的调节对象基因或序列时，NF-κB的不同亚单位形式的表达能力得到相应的保证。根据文献报道，功能性NF-κB的结合位点在诸如IL22、IL26、IL28、TNF、TNFβ、ICAM21、GM2CSF等许多基因的启动子或增强子上都具备了[4]。比如P50与P65这一二聚体结合的序列为5′ GGGRNNYYCC3′，此为NF-κB的标准形式； 5′ HGGARNYYCC3′这一序列则是 RelA/C-Rel二聚体的结合序列，其中R为嘌呤，Y为嘧啶，H代表A、C或T。在众多的NF-κB蛋白形式中，是负责激活转录的NF-κB复合体形式为P50/P65、P50/C-ReL、P65/C-ReL，而负责抑制转录的复合体形式是P50同源二聚体和P52同源二聚体。

2 NF-κB被激活的途径及其与TNF之间的联系

NF-κB在非激活条件下，以一种无活性形式存在于细胞浆内。此时NF-κB与NF-κB的抑制蛋白形成一种复合物。NF-κB是一种可被诱发的转录调节因子，其结合位点可以接受到种类繁多的免疫刺激，这其中常见的有病毒感染、T细胞激活剂、生长因子、IL21、LPS以及TNF等，这些因素均可轻松激活NF-κB[5]。IκB家族成员有IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBδ等，均为抑制NF-κB主要的蛋白。该家族拥有5～7个锚蛋白重复序列和C端PEST序列，锚蛋白重复序列与Rel蛋白相互作用，C端PEST序列和降解密切相关。NF-κB的核定位信号一般被IκB所掩盖，以无活性的形式在胞浆中被IκB滞留[6]。目前的研究以IκBα居多且详细深入，NF-κB的主要调控抑制蛋白就是IκBα，与它之具备有高亲和力的主要是含有RelA和C-Rel的二聚体，其他Rel与它的亲和力相对低很多。NF-κB/ReL的Rel同源区的氨基酸残基主要与它发生相互作用，从而掩盖了IκB结合的位点NLS，抑制了核易位使NF-κB滞留于胞浆。IκBα、IκBγ和IκBδ可与Rel蛋白中p50的前体p105以及p52的前体p100作用，因为其蛋白C端拥有锚蛋白重复序列，可经此重复序列与ReL蛋白N末端RHD产生二聚体化从而滞留在细胞浆。当胞外产生一个诸如TNF结合等的刺激以后，刺激再通过一或多个信号转录途径，激活了蛋白激酶，作用于原来以失活形式存在于胞浆中的NF-κB三聚体复合物，使其中的IκBα磷酸化，三聚体发生解离，IκBα游离出来，与泛素结合，变成泛素化的IκBα，其再被蛋白酶小体降解，最终使得二聚体NF-κB发生核转位[7]。此外还有一类IκB蛋白，即BCL-3，是跟独特的NF-κB二聚体产生交互作用，从而产生转录活性。BCL-3为一新发现蛋白，其位于细胞核，协同P50或P52同源二聚体发挥激活转录作用，而非抑制核易位或抑制DNA结合作用。不过BCL-3不能与P50的NLS区域结合[8]，这一结果与NF-κB和IκBα的相互作用是相反的。

目前，对激活NF-κB机制的研究逐渐透彻，已发现数个抗凋亡基因被NF-κB上调，而且现在对于NF-kB如何被各种细胞外诱导因素激活，和激活后信号如何传导到下游，以及各传导通路的共同交汇点已一些相对基本的常识。NF-κB的活化一般分成3条通路：（1）生存因子先与TRADD聚集，然后TRADD再与TRAF2结合，从而活化NIK（NF-κB inducing kinase，NF-κB诱导因子），NIK进一步活化IKκB复合物，使IκB迅速磷酸化，泛素化降解，释放NF-κB迅速发生核转位。而酪氨酸激酶可能在TRAF2活化NF-κB的过程中起重要作用[9]。（2）受体酪氨酸激酶（RTK）被生存因子信号激活，进而活化RAS-MEK信号通路，通过受体相互作用蛋白（RIP）MEK参与NIK的活化，最后促进NF-κB活化。此通路需要在shc/sos参与下。（3）PI3K被生存信号激活后，AKT使IκB磷酸化，致使其从NF-κB上分离，使NF-κB活化。AKT抑制剂可抑制NF-κB的活化。不同的刺激因素，活化NF-κB可能具有不同的通路，IκB的磷酸化即是各不同通路之间的共同点。如IL-1，TNF及LPS等典型的刺激炎症因子促使IkBα等IkBs产生磷酸化和降解的过程一般发生在数分钟以内。最初IkBα由激酶复合物IKK作用，在Ser32和Ser36两个位点[9-10]上发生磷酸化。IkBα磷酸化以后，迅速在分子中的Lys21及Lys22两个位点上发生泛素化[11-12]，这一过程由泛素连接酶复合物SCF（Skp-1/Cul/F-box）大家族成员中一个E3RSIkB/b-TrCP识别[13]。26S蛋白酶体能够识别泛素化的IkBα分子，并迅速降解之。IkBα降解以后，NF-κB即能从三聚体复合体中被释放和活化，活化的NF-kB暴露出其核定位序列来，然后即能迅速转位，进入细胞核，发挥转录启动功能。IKK复合物是由两个活性亚基IKKα和IKKβ以及一个调节性亚基IKKγ共同组成。Knockout实验证明，IKKβ和IKKγ也是NF-kB被炎症因子激活过程中不可缺少的成分。

活化的NF-κB发挥启动转录的功能后，将作用于各种特异的靶基因，诱导这些靶基因的表达，编码不同的前炎性蛋白质，诸如生长因子，IFN，细胞因子，细胞粘附因子等，诱导C-IAH，C-IAP2等凋亡抑制蛋白的基因表达，抑制一氧化氮合酶NOS的生成，诱导Bcl-x1，Bcl-2这些抗凋亡基因的表达。于细胞内外均可发生针对NF-κB的反馈调节，NF-κB的活化能够增加TNF、IL-1β等的转录水平，并且转录产物又可以反过来继续活化NF-κB。这就是通过细胞外机制放大刺激信号的正反馈。IκBα、p105基因的转录上调是对NF-κB的负反馈调节。细胞内NF-κB的活化，水平提高，会对此二基因上有作用，因为二者结构中均含有NF-κB的作用位点。P50二聚体随着p105的增加而增加，因为p50二聚体缺乏转录激活区域且不能与IκB有效结合，还可以通过竞争结合NF-κB结合位点来减少其他Rel蛋白与NF-κB的结合并抑制NF-κB介导的基因转录表达。因此，P50二聚体可以降低NF-κB的介导效果。这就是负反馈之一。此外负反馈也可由反向细胞因子来实现，这是细胞外刺激如IL-10、TNF或者IL-1等产生的。IL-10抑制NF-κB活化的过程是通过抑制内毒素实现的，也可达到抑制NF-κB进而降低某种细胞因子产生的效果[8]。

TNF-α与TNF-R1的结合能够激活PC-specific phospholipase C （PC-PLC），然后产生1，2二酰基甘油（1，2DAGs），1，2二酰基甘油（1，2DAGs）在顺序活化酸性鞘磷脂酶（acidic smase，SM）和蛋白激酶C（PKC）。这两种酶的作用途径并不一致，酸性鞘磷脂酶水解鞘磷脂产生神经酰胺（ceramide），神经酰胺可快速诱导NF-κB活化，通过一种尚未完全明确的途径，而蛋白激酶C活化NF-κB则通过其他途径。把NF-κB的调控信号分子（如TRAF2、ceramide）如何功能性地与TNF受体相关蛋白联系在一起是一个仍待研究的问题。

3 抑制NF-κB能使细胞对TNF更为敏感

对NF-κB的认识最初只限于细胞死亡相关等[10]。在应激、免疫和炎症刺激方面的作用也逐渐认识。小鼠缺乏NF-κB以后，观察到其肝脏细胞发生凋亡等退行性变，猜测这种现象可能与NF-κB有关，具体作用可能与胚胎细胞的凋亡能被NF-κB抑制相关，进而推论出NF-κB也可以降低肿瘤细胞的凋亡。许多肿瘤细胞中NF-κB的表达量非常高，细胞因子也有高量的表现，同时还表现出能抵抗TNF、射线、化疗等介导凋亡的作用。NF-κB含量的增加、细胞因子的产生以及细胞对凋亡的抵抗力之间存在着一定的密切关系，提示它们之间有一种内在的恒定联系。

给裸鼠移植大肠腺癌后再将NF-κB decoy腹腔注射，结果发现NF-κB decoy虽然没有影响肿瘤生长，却可抑制肿瘤引发的恶病质。进一步实验发现IL-6等细胞因子表达降低，这些因子与肿瘤恶病质效果是有关的。通过腺病毒载体将IκBα基因转染Jurkat、MEF细胞株，然后再用TNF-α处理，与对照组（单用TNF-α处理）作比较，凋亡率结果为MEF细胞株67%与8%，Jurkat细胞株44%与4%[9]。在前列腺癌细胞株DU145、PC3中，一组用TNF-α蛋白处理，另一组分别用NF-κB decoy和PDTC（pyrrolidine dithiocarbamate）联合处理细胞，结果发现，而单用TNF-α 50 ng/ml者，细胞生长正常，而NF-κB decoy联合TNF-α处理组中，细胞凋亡明显增加，TNF-α用量可减至20 ng/ml。可见联合应用NF-κB可以降低TNFα试用剂量并提高作用效果，而单纯抑制NF-κB却不能将肿瘤细胞直接杀伤[14]。在人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型上，联合应用全硫代修饰的NF-κB抑制剂-双链κB序列（AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC）与TNF-α基因进行治疗实验，结果比较与单用TNF-α基因治疗的对照组有显著性差异，前者抑瘤率近2倍于后者，单用NF-κB抑制剂结果同样对肿瘤生长无影响。可见直接诱导肿瘤生长进展并不是NF-κB的作用，但作为转录激活因子，NF-κB会对产生这些细胞因子从基因水平发挥作用。研究证明，PC-3和DU145等细胞系可以表达诸如GM-CSF、ICAM-1、IL-6、IL-8等多种不同的细胞粘附因子和细胞分子，这些因子在肿瘤细胞的生存、生长中起不同的重要维持作用。NF-κB被活化后，转录调控不同的细胞分子，从而产生不同的效应，这些均被以上实验证实。不过也有不同的声音，在肺鳞状细胞癌，应用携带IκBα基因的腺病毒载体做转染处理，结果肿瘤细胞的生长被深度抑制，在其他实验中也发现部分肿瘤细胞的生长可以被单纯转染IκBα所抑制，但这一结果不能适用于所有情况，讨论中认为可能与某些细胞因子的产生从而导致肿瘤存活有关，也可能与细胞类型的不同和实验因素影响体内外环境不同相关[15]。

通过转录上调癌基因，NF-κB能促进肿瘤的存活，如bcl-2和ras的上调表达，并在介导细胞存活和转化中起到作用等等[11-12]。单独使用NF-κB decoy或IκBα，能够抑制肿瘤生长，或者在多大程度上抑制生长，这些还需要做深层次的研究。但是，抑制NF-κB能使肿瘤细胞对TNF更为敏感，这一点是很肯定的。TNF-α需要抑制蛋白的参与来促进和诱导凋亡。某些肿瘤细胞对TNFα具有天然抗性，如能通过NF-κB的激活，上调一些相关基因的转录，来编码抑制凋亡的蛋白，来促进TNF-α对caspase-8的激活，即可增敏肿瘤细胞的TNF的反应。有几个基因c-IAP1&2、TRAF1&2可在此发挥作用。TNFα通过破坏肿瘤微血管系统导致坏死和凋亡诱导这两个方面因素来使肿瘤消减加速[16]。前者目前研究较少，但诱导凋亡的研究有很多。实验证明，IκBα联合TNFα治疗，可使85%的动物体内瘤体完全消减，代之以瘢痕，对照组这一数据仅为15%。

虽然联合应用NF-κB抑制剂可提高TNF抗肿瘤药物的效果，目前将NF-κB实际应用于临床仍有几个问题。一是NF-κB是一个广泛存在的分子，对它的抑制可使非肿瘤组织受到非特异性负面作用[15]。人工合成的NF-κB活性抑制剂如NF-κB decoy等，多数会发生很大的副作用，这些往往是由于那些非特异性的活性引起的。有报道已发现非转化细胞发生了凋亡是由于IκBα基因转染引起的[17]。二是需要提高IκBα基因治疗的转化效率来达到更好的成功率，但目前并不存在转化效率达到100 %的载体，因此，能够筛选出一种转化率高的载体变得很重要。现在大家正在探索的新的研究方向，一种就是找到天然存在的NF-κB 活性抑制剂，再一种方法就是共同联合其他凋亡基因，这也可能会产生超出预期的好效果。有研究用FADD基因转染也可以使肿瘤细胞发生凋亡[18]，推想如果能将NF-κB抑制剂与FADD联合应用会有好效果。

这些在NF-κB研究领域取得的成果，为TNF抗肿瘤的应用提供新的思路。预期未来NF-κB在提高TNF效应，减少TNF用药量、降低TNF的毒副作用方面会发挥其关键作用。综合文献报道，NF-κB的功能涉及到多种病理过程[19-21]。虽然某些信号通路研究和作用机制已取得大量数据，但是NF-κB家族与IκB家族成员众多，靶细胞类型多种多样，信号转导通路多且繁杂，各种通路所需要的具体分子存在差异，NF-κB深层次的作用机制与原理还有待更多更深入的研究[22-25]。相信今后经过研究人员的不懈努力，NF-κB与机体、细胞、蛋白、基因和分子之间的调节作用与相互机制会得到进一步完善和提高，在TNF抗肿瘤的应用中能够越来越成熟。

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